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friya0910

新虫 (正式写手)

[求助] 表达载体构建的相关问题

现在要构建表达载体,有一些问题不是很明确,希望懂得的不吝赐教啊!
首先是双酶切表达载体和带有目的片段的T载体,一般都切多少时间啊?我看有说切过夜的,也有切几个小时的!切完以后大家都从哪些方面确定酶切完全不完全呢?
其次是连接以后除了直接转化以外,还有什么方法确定是否连接上了呢?
本人新手一个,对于这方面不是很了解,希望各位帮帮忙!
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千king寻

铜虫 (初入文坛)

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励反馈哦 2011-07-21 11:23:33
 金属浴:采用微电脑控制和半导体制冷技术制造的一款恒温金属浴产品,仪器可配置多种模块,可广泛应用于样品的保存、各种酶的保存和反应、核酸和蛋白质的变性处理、PCR 反应、电泳的预变性和血清凝固等。  
   性能特点:
★微电脑数显控制温度.
★采用先进的热电膜加热技术.
★同时显示设置温度和即时温度.
★采用金属模块,可使样品免受污染.
★金属模块可方便更换,便于清洁、消毒和适用各种试管.
★内置超温保护装置,使用更可靠.
★温度偏差校准。
这是在说明书上写的,具体的我也不是太清楚,我们实验室在进行目的基因连接到载体上时都是在金属浴16度过夜连接的。
10楼2011-07-21 10:34:11
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖

★ ★
friya0910(金币+2): 2011-07-18 15:25:29
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-07-18 16:32:08
friya0910(金币+1): 2011-07-19 17:10:50
如果你的片段大的话就过夜切吧,我一般都是过夜切,用fermentas的酶。如果不过夜切的话,中间隔4-5个小时就差不多吧。确定连接与否,你可以做一下菌落pcr,p一下你的目的条带。好好做,加油!
生命即这般无尽变数,辗转来去皆苛求不得
2楼2011-07-18 15:18:40
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friya0910

新虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 青菜小虫 at 2011-07-18 15:18:40:
如果你的片段大的话就过夜切吧,我一般都是过夜切,用fermentas的酶。如果不过夜切的话,中间隔4-5个小时就差不多吧。确定连接与否,你可以做一下菌落pcr,p一下你的目的条带。好好做,加油!

菌落PCR的话就还是要把连接液做转化喽,看来没有什么捷径啊!我的片段不大,才300bp,“中间隔4-5个小时”是什么意思啊?
3楼2011-07-18 15:27:39
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-07-18 16:32:39
friya0910(金币+1): 2011-07-19 17:10:57
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-07-18 15:27:39:
菌落PCR的话就还是要把连接液做转化喽,看来没有什么捷径啊!我的片段不大,才300bp,“中间隔4-5个小时”是什么意思啊?

就是酶切时间4或5个小时啦,你的片段这么小哇。那你怎么做连接啊?
生命即这般无尽变数,辗转来去皆苛求不得
4楼2011-07-18 15:36:51
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