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friya0910新虫 (正式写手)
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表达载体构建的相关问题
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现在要构建表达载体，有一些问题不是很明确，希望懂得的不吝赐教啊！ 首先是双酶切表达载体和带有目的片段的T载体，一般都切多少时间啊？我看有说切过夜的，也有切几个小时的！切完以后大家都从哪些方面确定酶切完全不完全呢？ 其次是连接以后除了直接转化以外，还有什么方法确定是否连接上了呢？ 本人新手一个，对于这方面不是很了解，希望各位帮帮忙！ |
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2楼2011-07-18 15:18:40
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3楼2011-07-18 15:27:39
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就是酶切时间4或5个小时啦，你的片段这么小哇。那你怎么做连接啊？ 4楼2011-07-18 15:36:51
friya0910
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5楼2011-07-18 15:44:30
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，你说你做用转化液做转化那几句我没看懂。6楼2011-07-18 17:03:37
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!金属浴没听说过，孤陋寡闻了……连接时我们一般放15度培养箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金币+5): 2011-07-20 17:59:26
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!金属浴没听说过，孤陋寡闻了……连接时我们一般放15度培养箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金币+5): 2011-07-20 17:59:26
| 双酶切37度水浴2——3个小时，之后琼脂糖凝胶电泳观察条带，若条带正确则切胶回收，此时回收的为带有两个酶切位点的目的片段。该目的片段与已经带有该酶切位点的载体进行连接，若用T4连接酶，则需16度金属浴过夜连接，之后进行转化、培养皿过夜培养，挑取3个左右生长良好、单个的菌落于5毫升左右的培养液中37度摇床培养6个小时，进行PCR鉴定是否成功，若电泳观察条带正确则抽质粒，即为连到载体且含有酶切位点的质粒，也可再次进行双酶切鉴定。 |
7楼2011-07-20 14:04:28
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-07-20 16:13:23
friya0910(金币+1): 2011-07-20 17:59:31
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friya0910(金币+1): 2011-07-20 17:59:31
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看一下这两个帖子吧http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2311683 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3069329 |
8楼2011-07-20 14:40:29
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9楼2011-07-20 21:12:08
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西瓜(金币+2): 鼓励反馈哦 2011-07-21 11:23:33
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金属浴：采用微电脑控制和半导体制冷技术制造的一款恒温金属浴产品，仪器可配置多种模块，可广泛应用于样品的保存、各种酶的保存和反应、核酸和蛋白质的变性处理、PCR 反应、电泳的预变性和血清凝固等。 性能特点： ★微电脑数显控制温度. ★采用先进的热电膜加热技术. ★同时显示设置温度和即时温度. ★采用金属模块，可使样品免受污染. ★金属模块可方便更换，便于清洁、消毒和适用各种试管. ★内置超温保护装置，使用更可靠. ★温度偏差校准。 这是在说明书上写的，具体的我也不是太清楚，我们实验室在进行目的基因连接到载体上时都是在金属浴16度过夜连接的。 |
10楼2011-07-21 10:34:11
