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friya0910新虫 (正式写手)
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[求助]
表达载体构建的相关问题
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现在要构建表达载体，有一些问题不是很明确，希望懂得的不吝赐教啊！ 首先是双酶切表达载体和带有目的片段的T载体，一般都切多少时间啊？我看有说切过夜的，也有切几个小时的！切完以后大家都从哪些方面确定酶切完全不完全呢？ 其次是连接以后除了直接转化以外，还有什么方法确定是否连接上了呢？ 本人新手一个，对于这方面不是很了解，希望各位帮帮忙！ |
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!金属浴没听说过，孤陋寡闻了……连接时我们一般放15度培养箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金币+5): 2011-07-20 17:59:26
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!金属浴没听说过，孤陋寡闻了……连接时我们一般放15度培养箱。 2011-07-20 16:13:11
friya0910(金币+5): 2011-07-20 17:59:26
| 双酶切37度水浴2——3个小时，之后琼脂糖凝胶电泳观察条带，若条带正确则切胶回收，此时回收的为带有两个酶切位点的目的片段。该目的片段与已经带有该酶切位点的载体进行连接，若用T4连接酶，则需16度金属浴过夜连接，之后进行转化、培养皿过夜培养，挑取3个左右生长良好、单个的菌落于5毫升左右的培养液中37度摇床培养6个小时，进行PCR鉴定是否成功，若电泳观察条带正确则抽质粒，即为连到载体且含有酶切位点的质粒，也可再次进行双酶切鉴定。 |
7楼2011-07-20 14:04:28
青菜小虫
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2楼2011-07-18 15:18:40
friya0910
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3楼2011-07-18 15:27:39
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就是酶切时间4或5个小时啦，你的片段这么小哇。那你怎么做连接啊？ 4楼2011-07-18 15:36:51
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