| 查看: 1500 | 回复: 6 | |||
xtcao668木虫 (著名写手)
|
[交流]
【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题已有4人参与
|
|
各位网友，目前在做酿酒酵母表达，我外源基因片段酶切位点在我用的真核表达载体pYX212上没有合适位点。但是，由于该表达载体上有限制性酶EcoR V 的酶切位点，我用EcoR V 酶切后72摄氏度加dTTP两个小时，经琼脂糖凝胶电泳或者酚氯仿沉淀后，按载体：外源基因=1-(3~7)加T4酶连接过夜后先转化感受态大肠杆菌，但是做过多次均是载体自连(经双酶切鉴定)； 并且载体：外源基因=1：10 也做过，还将载体先在45度上保温后再加T4酶和buffer，结果也是载体自连。 特来求助，用碱性磷酸酶去磷酸化处理去磷酸化是不是可以避免载体自连？去磷酸化后要凝胶回收吗（凝胶回收效率很低）？还有就是去磷酸化后连接时需要加入ATP吗？(一般是载体、外源基因、T4酶、T4 buffer) 希望做过的网友支持一下。 抱歉，有点长，谢谢啦！ |
回复此楼» 猜你喜欢
球磨纳米粒子条件
已经有6人回复
-
球磨分散剂
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有62人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 酿酒酵母 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 八叠藤黄球菌 分别属于G+ 还是G-？
已经有3人回复
- 求助一个关于酿酒酵母转化的问题
已经有19人回复
- 酿酒酵母 摇瓶问题
已经有10人回复
- 请问大肠杆菌和酿酒酵母（或必赤酵母）进行蛋白质表达哪个成本高？
已经有14人回复
- 酿酒酵母基因组PCR出了16S的条带
已经有8人回复
- 酿酒酵母转化建立突变库
已经有13人回复
- 重组酿酒酵母转化子筛选的问题
已经有12人回复
- 求助酿酒酵母菌种选育方面的专家（项目合作）！急
已经有6人回复
- 急求酿酒酵母的电转感受态制备方法和转化方法
已经有13人回复
- 20金币 求助关于酿酒酵母的放大培养
已经有9人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题
已经有30人回复
- 【求助/交流】急！酿酒酵母破壁及SDS-PAGE电泳问题
已经有14人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母利用半乳糖的问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母质粒转化大肠杆菌
已经有11人回复
- 【求助/交流】酿酒酵母drop-out的配置~~
已经有12人回复
tianpingpe
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 448.6
- 红花: 1
- 帖子: 111
- 在线: 43.1小时
- 虫号: 900044
- 注册: 2009-11-11
- 专业: 环境微生物学
2楼2009-12-14 11:44:04
zhaocy8903
木虫 (知名作家)
- 应助: 24 (小学生)
- 金币: 3870.5
- 散金: 1238
- 红花: 17
- 帖子: 5797
- 在线: 1468.2小时
- 虫号: 636507
- 注册: 2008-10-25
- 专业: 微生物遗传育种学
3楼2009-12-14 12:20:43
308145157
木虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 23.8
- 散金: 16
- 帖子: 1058
- 在线: 255.1小时
- 虫号: 787692
- 注册: 2009-06-05
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
4楼2010-07-05 15:13:34
5楼2010-07-05 15:21:17
fungixx
至尊木虫 (文坛精英)
- 应助: 37 (小学生)
- 贵宾: 3.458
- 金币: 19798.1
- 散金: 18645
- 红花: 118
- 沙发: 273
- 帖子: 13300
- 在线: 2020.5小时
- 虫号: 860534
- 注册: 2009-09-30
- 专业: 抗肿瘤药物药理
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
|
T载体不能去磷酸化吧，去了还能连上吗 怀疑！ 觉得很可能是你根本没有加上T，或者是单酶切不充分。。。加dTTP后是不是应该加上taq,没见你提到。。。 下面是T载体制备方法，你比较一下看看吧。。。。 http://my.muchong.com/space.php?uid=860534&do=blog&id=130794 |
6楼2010-07-05 15:38:36
7楼2012-12-09 22:42:13
10