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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题 已有4人参与

各位网友，目前在做酿酒酵母表达，我外源基因片段酶切位点在我用的真核表达载体pYX212上没有合适位点。但是，由于该表达载体上有限制性酶EcoR V 的酶切位点，我用EcoR V 酶切后72摄氏度加dTTP两个小时，经琼脂糖凝胶电泳或者酚氯仿沉淀后，按载体：外源基因=1-(3~7)加T4酶连接过夜后先转化感受态大肠杆菌，但是做过多次均是载体自连(经双酶切鉴定)； 并且载体：外源基因=1：10 也做过，还将载体先在45度上保温后再加T4酶和buffer，结果也是载体自连。
    特来求助，用碱性磷酸酶去磷酸化处理去磷酸化是不是可以避免载体自连？去磷酸化后要凝胶回收吗（凝胶回收效率很低）？还有就是去磷酸化后连接时需要加入ATP吗？(一般是载体、外源基因、T4酶、T4 buffer) 希望做过的网友支持一下。

    抱歉，有点长，谢谢啦！
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生活的理想就是理想的生活
1楼 2009-12-14 11:08:10
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
1949stone(金币+2,VIP+0):谢谢交流 12-14 12:35
xtcao668(金币+5,VIP+0):乐于助人 12-14 18:53
用碱性磷酸酶去磷酸化是可以避免载体自连，一般去磷酸化是乙醇沉淀回收。
如果没有合适的酶切位点，你可以通过pcr的手段添加合适的，或者是添加同尾酶也是可以的。
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2楼2009-12-14 11:44:04
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★ ★ ★ ★
1949stone(金币+1,VIP+0): 12-14 12:35
xtcao668(金币+3,VIP+0):乐于助人 12-14 18:53
可以考虑INFUSION技术
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3楼2009-12-14 12:20:43
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308145157

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
使用LIC（Ligation Independent Cloning）技术吧，不需要考虑酶切位点的影响。挑重组子基本百分百正确。
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心若在，梦就在......
4楼2010-07-05 15:13:34
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天外飞仙→顺

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-07-05 15:27:57
载体自连有两个原因：  一是你的目的基因没有切开，可能是酶加的少
                      二是你的目的基因浓度太低了，可以用核算定量仪测试一下


祝实验顺利
赞一下(2人) 回复此楼
我无法改变自己的出生，但我可以决定自己的命运：命中注定我是一个王者，我必须拿出王者的风范！！！
5楼2010-07-05 15:21:17
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
T载体不能去磷酸化吧，去了还能连上吗  怀疑！
觉得很可能是你根本没有加上T，或者是单酶切不充分。。。加dTTP后是不是应该加上taq,没见你提到。。。
下面是T载体制备方法，你比较一下看看吧。。。。
http://my.muchong.com/space.php?uid=860534&do=blog&id=130794
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-07-05 15:38:36
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jane晨宝儿

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
有没有可能是你的连接用的目的基因浓度太低的原因？可以测试下，如果目的基因浓度特别低，而载体浓度又很高的话，载体自连就很容易发生的。去试试。
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7楼2012-12-09 22:42:13
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