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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母， 一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满； 后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
   接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长， 现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。 请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
  比较啰嗦 见谅！  谢谢帮忙
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1楼 2011-01-13 09:13:08
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
by4741 和by4742 是单倍体
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21楼2014-01-10 17:38:42
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金币+1): 2011-01-13 10:18:20
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/SD-URA，说明只敲除了一半，要重新设计引物二次敲除。
2、最好不要选取工业二倍体酵母作为实验酵母，分子操作上会很麻烦，最好选用试验用的单倍体酵母。
3、酿酒酵母dropout类型现在又很多了，搞到一个URA3缺陷型的菌株也不难，何必自己敲除，费时又费力。
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2楼2011-01-13 09:41:17
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
参考invitrogen的EBY100和pYD1质粒
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3楼2011-01-13 12:58:16
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nacissu

金虫 (初入文坛)
旁观学习一下
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4楼2011-06-09 17:51:26
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yatou996512

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
请问一下，我也是要做URA3的筛选，你配培养基的时候，尿嘧啶和5-FOA高压灭菌了吗？如果没有，这两种药品，你是怎么配制的，按理化性质来说，特别不好溶解，谢谢
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5楼2011-10-10 16:58:49
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
5-FOA 可以溶于DMSO或者50mM的NaOH ,然后过滤除菌
URA3 也需要过滤除菌
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6楼2011-10-11 08:24:58
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
不好意思 说错了 5-FOA用DMSO 溶解
   URA3 用50 mM NaOH溶解后过滤除菌 二者均不能高压 配成高浓度按所需量加入SD 培养基
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7楼2011-10-11 08:26:57
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香蕉宝宝

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你好！我现在遇到和你类似的问题，敲除URA3之后，在FOA上能生长，但是也能在不含尿嘧啶的培养基上能生长，因此想请教一下，我的也是二倍体！
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8楼2011-12-05 09:43:46
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原野漫漫

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-03-29 21:39:53
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质， 使细胞无法生长。
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10楼2013-03-20 19:46:53
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问，你G418筛选产物是不是就是neo基因啊？
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11楼2013-04-02 19:57:05
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jiaoxiayoulu

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问，G418筛选产物是不是就是neo基因啊？
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12楼2013-04-02 19:59:14
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
G418是一种氨基糖类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合
成，对原梭和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母，植物和哺乳动物细胞，
是稳定转染最常用的选择试剂。Wach等人研究发现，来自大肠杆菌转座子Tn903
的卡那霉素抗性基因与表达调控序列来自丝状真菌Ashbyagossypii(针孢酵母)
的TEF基因相融合，所组成的kanMX元件可以在酵母细胞中表达氨基糖苷磷
酸转移酶，将G418转变成无毒形式，从而赋予酵母细胞以G418抗性
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13楼2013-04-03 17:09:41
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问你做的酿酒酵母是生产什么的工业酵母啊，代号多少呢，希望进一步交流，我的是黄酒生产菌株酿酒酵母N85。
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14楼2013-05-23 15:59:45
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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5楼: Originally posted by yatou996512 at 2011-10-10 16:58:49
请问一下，我也是要做URA3的筛选，你配培养基的时候，尿嘧啶和5-FOA高压灭菌了吗？如果没有，这两种药品，你是怎么配制的，按理化性质来说，特别不好溶解，谢谢

5-FOA在水中溶解的话，需要在50度水浴30min，才能充分溶解的，然后再过滤就可以了，尿嘧啶也是可以在水中溶解的，稍微加热下就可以溶解的，然后再过滤，以后每天添加之前，最好再加热一下混匀。
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15楼2013-05-23 16:03:06
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该用单倍体进行分别敲除，然后再杂交培养基上融合形成二倍体。
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16楼2013-05-23 16:32:26
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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8楼: Originally posted by 香蕉宝宝 at 2011-12-05 09:43:46
你好！我现在遇到和你类似的问题，敲除URA3之后，在FOA上能生长，但是也能在不含尿嘧啶的培养基上能生长，因此想请教一下，我的也是二倍体！

请问你敲的是代号多少的酿酒酵母啊，是用化转的还是电转的啊，目前也在做URA3的敲除，希望可以多多交流。
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17楼2013-06-03 19:32:34
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冰艺于欣然

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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2楼: Originally posted by susizheng at 2011-01-13 09:41:17
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/S ...

我要用酿酒酵母做基因的过表达，老师说我们现在的菌株是工业菌株，是二倍体，不太好做，我最近在网上查菌株呢。ATCC 204508是很多突变株的亲代菌株，那是不是是二倍体啊？还有很多文献用到Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D，可是我在网上都查不到哪儿有卖的。。。您知道什么单倍体菌株比较适合做过表达的么？我刚接课题，很菜鸟，请见谅啊。。。
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18楼2013-11-08 10:20:49
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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18楼: Originally posted by 冰艺于欣然 at 2013-11-08 10:20:49
我要用酿酒酵母做基因的过表达，老师说我们现在的菌株是工业菌株，是二倍体，不太好做，我最近在网上查菌株呢。ATCC 204508是很多突变株的亲代菌株，那是不是是二倍体啊？还有很多文献用到Saccharomyces cerevisia ...

你好，做酿酒酵母好像是三四年前的事了，二倍体做基因敲除是麻烦。但是做过表达并不影响啊。用二倍体做一样的，即使转进去一半一样可以表达。另外我只用过WT strain (BY4741 [genotype, Mata his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0])这个菌株，也是二倍体的。
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19楼2013-11-08 11:17:07
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三蛰

铜虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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19楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 11:17:07
你好，做酿酒酵母好像是三四年前的事了，二倍体做基因敲除是麻烦。但是做过表达并不影响啊。用二倍体做一样的，即使转进去一半一样可以表达。另外我只用过WT strain (BY4741 )这个菌株，也是二倍体的。...

你确定BY4741是两倍体？
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20楼2014-01-10 15:25:58
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hihe99

银虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by xtcao668 at 2011-10-11 09:26:57
不好意思 说错了 5-FOA用DMSO 溶解
   URA3 用50 mM NaOH溶解后过滤除菌 二者均不能高压 配成高浓度按所需量加入SD 培养基

你好，请问下，我好像在做其他实验的时候查到说DMSO不能过滤，会把滤膜也给溶解了，请问你是用的什么样的滤膜？
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22楼2014-04-15 16:26:47
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冰艺于欣然

新虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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20楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-10 15:25:58
你确定BY4741是两倍体？...

是单倍体，模式菌吧~~
亲，想问下，BY4741的基因组，除了敲除的几个基因，是不是都和S288C一样啊？它是模式菌，可是在NCBI上找不到它的基因组哎
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23楼2014-09-23 17:09:30
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paopaoyu1991

金虫 (小有名气)
★
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19楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 11:17:07
你好，做酿酒酵母好像是三四年前的事了，二倍体做基因敲除是麻烦。但是做过表达并不影响啊。用二倍体做一样的，即使转进去一半一样可以表达。另外我只用过WT strain (BY4741 )这个菌株，也是二倍体的。...

亲还在吗，我想问你关于酵母过表达的问题，能给我一个联系方式吗
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24楼2015-01-07 13:36:59
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paopaoyu1991

金虫 (小有名气)
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23楼: Originally posted by 冰艺于欣然 at 2014-09-23 17:09:30
是单倍体，模式菌吧~~
亲，想问下，BY4741的基因组，除了敲除的几个基因，是不是都和S288C一样啊？它是模式菌，可是在NCBI上找不到它的基因组哎...

我也没有找到他的基因组，最后你是怎么解决的呀，用的S288C设计引物P的吗
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25楼2015-01-20 10:39:10
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chrqrq09

铁虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by susizheng at 2011-01-13 09:41:17
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/S ...

我就有点不理解了，为什么采用同源臂来敲除S.cerevisiae的ura3基因后，转化子能在含有2mg/ml的FOA的YPD固体平板上生长，而不敲除的对照是不能生长的，说明ura3基因是被破坏的，不然表达的产物能将FOA转化为有毒的产物，导致不能生长，但转化子却能在含有FOA上生长（2mg/ml）。但是再转接到YNB不加尿嘧啶的平板上，却又能生长，说明ura3基因又没有被破坏，要是破坏了，在YNB不含尿嘧啶的平时上是不能生长的。
2楼认为是二倍体的话，若敲除的是其中的一个ura3基因，那么在含有2mg/ml的FOA平板上照样也是不能生长的，因为没有被敲除的这个ura3基因仍会表达并将FOA分解成有毒的产物，导致转化子不能生长。以二倍体来解释为什么转化子在YNB不加尿嘧啶的平板上能生长是解释的通的，但无法解释为什么仍能在含有FOA的平板上生长。
我做其它的酵母，比如Yarrowia lipolytica也遇到同样的问题。
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26楼2015-05-12 09:59:02
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aixiachun

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23楼: Originally posted by 冰艺于欣然 at 2014-09-23 17:09:30
是单倍体，模式菌吧~~
亲，想问下，BY4741的基因组，除了敲除的几个基因，是不是都和S288C一样啊？它是模式菌，可是在NCBI上找不到它的基因组哎...

在ATCC上查，BY4741来源于S288C，只是有些基因（那几个营养缺陷的）被敲除了。所以其他的基因都一样。
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27楼2016-03-22 16:41:14
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aixiachun

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25楼: Originally posted by paopaoyu1991 at 2015-01-20 10:39:10
我也没有找到他的基因组，最后你是怎么解决的呀，用的S288C设计引物P的吗...

就是用S288C
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28楼2016-03-22 16:42:59
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seeeea

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26楼: Originally posted by chrqrq09 at 2015-05-12 09:59:02
我就有点不理解了，为什么采用同源臂来敲除S.cerevisiae的ura3基因后，转化子能在含有2mg/ml的FOA的YPD固体平板上生长，而不敲除的对照是不能生长的，说明ura3基因是被破坏的，不然表达的产物能将FOA转化为有毒的产 ...

你好 我也做的是解脂亚洛酵母的URA3敲除，也出现了你所说的转化子在5-FOA板上和-u板上都正常生长的情况。请问，你配5-FOA培养基的时候，有调ph值吗？方便告知配置培养基的方法吗？ 谢谢
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29楼2018-01-10 17:22:55
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dirkyoung

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26楼: Originally posted by chrqrq09 at 2015-05-12 10:59:02
我就有点不理解了，为什么采用同源臂来敲除S.cerevisiae的ura3基因后，转化子能在含有2mg/ml的FOA的YPD固体平板上生长，而不敲除的对照是不能生长的，说明ura3基因是被破坏的，不然表达的产物能将FOA转化为有毒的产 ...

您好，请问您的问题解决了吗？我也想做2倍体酵母URA3的敲除
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30楼2021-06-14 16:06:23
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chaoxu

禁虫
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31楼2022-10-10 09:47:03
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