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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母， 一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满； 后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
   接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长， 现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。 请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
  比较啰嗦 见谅！  谢谢帮忙
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1楼 2011-01-13 09:13:08
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
不好意思 说错了 5-FOA用DMSO 溶解
   URA3 用50 mM NaOH溶解后过滤除菌 二者均不能高压 配成高浓度按所需量加入SD 培养基
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7楼2011-10-11 08:26:57
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金币+1): 2011-01-13 10:18:20
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/SD-URA，说明只敲除了一半，要重新设计引物二次敲除。
2、最好不要选取工业二倍体酵母作为实验酵母，分子操作上会很麻烦，最好选用试验用的单倍体酵母。
3、酿酒酵母dropout类型现在又很多了，搞到一个URA3缺陷型的菌株也不难，何必自己敲除，费时又费力。
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2楼2011-01-13 09:41:17
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
参考invitrogen的EBY100和pYD1质粒
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3楼2011-01-13 12:58:16
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yatou996512

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
请问一下，我也是要做URA3的筛选，你配培养基的时候，尿嘧啶和5-FOA高压灭菌了吗？如果没有，这两种药品，你是怎么配制的，按理化性质来说，特别不好溶解，谢谢
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5楼2011-10-10 16:58:49
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