24小时热门版块排行榜

>论坛更新日志 (4244)
>文献求助 (467)
>虫友互识 (368)
>导师招生 (298)
>考博 (171)
>招聘信息布告栏 (158)
>硕博家园 (147)
>论文道贺祈福 (111)
>休闲灌水 (108)
>博后之家 (97)
>考研 (85)
>论文投稿 (78)
>基金申请 (65)
>教师之家 (62)
>公派出国 (51)
>找工作 (48)

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

应助: 10 (幼儿园)
金币: 20473.8
帖子: 1109
在线: 61.1小时
虫号: 481086

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母，一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满；后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长，现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
比较啰嗦见谅！谢谢帮忙

回复此楼

» 抢金币啦！回帖就可以得到:
查看全部散金贴

1楼2011-01-13 09:13:08

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

应助: 55 (初中生)
金币: 7107.8
帖子: 432
在线: 152.9小时
虫号: 1082982

参考invitrogen的EBY100和pYD1质粒

赞一下

回复此楼

3楼2011-01-13 12:58:16

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 31 个回答

susizheng

木虫 (著名写手)

★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金币+1): 2011-01-13 10:18:20

1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/SD-URA，说明只敲除了一半，要重新设计引物二次敲除。
2、最好不要选取工业二倍体酵母作为实验酵母，分子操作上会很麻烦，最好选用试验用的单倍体酵母。
3、酿酒酵母dropout类型现在又很多了，搞到一个URA3缺陷型的菌株也不难，何必自己敲除，费时又费力。

赞一下(1人)

回复此楼

2楼2011-01-13 09:41:17

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖