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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌基因敲除怪现象
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syn1985

木虫 (正式写手)

[交流] 链霉菌基因敲除怪现象

我做链霉菌in frame deletion做了好几个月了 这月初用菌落PCR方法检测到了突变株真的好开心 然后就发酵 LCMS检测发现产物还在 我就觉得很郁闷 然后我重新分了单克隆 取单克隆的孢子做了菌落PCR PCR检测发现扩增结果比野生小 大小和预期的也一样 测序结果也是对的 可是用目标基因的特异性引物扩增竟然也能扩出目的大小条带 这是怎么回事 这是我检测手段有问题还是这个菌里面有另一个拷贝啊
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iijs

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1楼 2012-04-16 14:33:52
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syn1985

木虫 (正式写手)
从构建载体开始到筛到突变株 顺的话2个月吧
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3楼2012-04-16 16:02:20
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果子么么茶

木虫 (著名写手)
★
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顶一下 真是什么情况都有 我还没有做到这一步  希望楼主早日找到原因及解决方案 共享一下
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5楼2012-04-16 18:16:39
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普通回帖

iijs

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
敲除得多长时间啊
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2楼2012-04-16 15:55:42
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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syn1985: 金币+3 2012-04-16 18:41:03
zhang8826857: 金币+3, 分析的有道理 2012-04-16 23:12:32
用目标基因的特异性引物扩增也能扩出目的大小条带，有两种可能：一种可能是非特异性扩增，这个应该好排除，可以通过测序等。另一种可能就是这一个基因在你的这个菌里面有另一个拷贝，当然前提是你要确定你的这个菌是纯的，没有污染（指的是突变株里面混杂有野生型菌株）。希望对你有用。
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4楼2012-04-16 16:56:27
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zct2008 at 2012-04-16 16:56:27:
用目标基因的特异性引物扩增也能扩出目的大小条带，有两种可能：一种可能是非特异性扩增，这个应该好排除，可以通过测序等。另一种可能就是这一个基因在你的这个菌里面有另一个拷贝，当然前提是你要确定你的这个菌 ...

谢谢 我这菌用孢子悬液涂得平板 确定是纯的 无杂菌 我今天将测序结果送去测序了 等后天结果出来了再看吧
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6楼2012-04-16 18:40:43
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)
★
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单交换，需要松弛培养..
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7楼2012-04-16 18:41:11
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-04-16 18:41:11:
单交换，需要松弛培养..

不是单交换的 做过松弛培养 菌体已经消失抗性 敲除菌体确定的引物是设计在目的基因两侧 所以扩增的片段会比预期小800bp 如果是单交换的话 扩出来的片段应该很大很大
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8楼2012-04-16 18:44:10
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
★
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我想问下你们链霉菌的那个载体是买的，还是自己构建的啊，可以问下你们是哪个学校么，我最近也在做这个
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9楼2012-04-18 09:00:05
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xzx018 at 2012-04-18 09:00:05:
我想问下你们链霉菌的那个载体是买的，还是自己构建的啊，可以问下你们是哪个学校么，我最近也在做这个

你说的是哪个载体？
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10楼2012-04-18 10:01:39
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syn1985

木虫 (正式写手)
今天测序结果回来了 送了2对 一个是敲除引物扩增的 里面确实少了一段目的基因 而且还多了我自己加进去的酶切位点 另一个是用目的基因的ORF扩增 扩增结果和我目的基因完全一样 疯了我 这到底怎么回事 这能说明我那个是有重复序列还是我的敲除质粒有残余啊？
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11楼2012-04-18 15:04:16
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by syn1985 at 2012-04-18 10:01:39:
你说的是哪个载体？

加载目的基因的那个载体
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12楼2012-04-18 16:56:22
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syn1985

木虫 (正式写手)
找人家求的啊
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13楼2012-04-18 19:37:00
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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syn1985: 金币+3 2012-04-19 18:31:24
祝实验顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:16 ]
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14楼2012-04-19 18:14:31
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 18:14:31:
呵呵，PCR扩增时两个条带分别有多大？敲除的是什么基因？根据表述可能还是没有重组完全，建议再松弛培养一次挑单克隆验证应该就好啦！

PCR扩增时用2种引物 一种是敲除引物 一种是目的基因的orf引物 目的基因片段长度为800左右 以WT为模板敲除引物扩增片段为2000bp左右 去除目的基因后是1200，这些PCR结果和测序结果都正确，菌之前做松弛培养时已经养了4代 然后验证正确后又传了一代 然后再分离了一次单菌落 一共有6代了
重组不完全是什么情况？我这个基因是一个化合物合成的前体合成辅酶A
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15楼2012-04-19 18:28:42
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 18:14:31:
呵呵，PCR扩增时两个条带分别有多大？敲除的是什么基因？根据表述可能还是没有重组完全，建议再松弛培养一次挑单克隆验证应该就好啦！

另外 重组不完全是什么样的情况啊 不太懂 这种情况是怎么发生的呢？
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16楼2012-04-19 18:36:47
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
祝顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:15 ]
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syn1985
17楼2012-04-19 19:06:07
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syn1985

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
17楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 19:06:07:
1）我的意思是你的菌可能还是杂合体，既有WT也有mutant，或者说你还没有纯化好，或者你能确认你挑的单克隆没有问题吗？
2)我建议你用这个克隆的孢子（确认是孢子）再划一下平板，待长出单克隆后再验证。
3）当 ...

1）我一开始怀疑是不是里面混了WT的 所以就刮孢子做了孢子悬液然后稀释涂了板子 所以挑的单克隆是没有问题的
2）我明天按照你说的再重新划一下板子 再分离一下看看
3）按照你这种验证方法 如果得到的检测结果是一样的 这说明是多拷贝还是啥 我不太明白这种检测得出的结果该如何分析是否有另一个拷贝
谢谢了！
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18楼2012-04-19 20:09:06
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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syn1985: 金币+4 2012-04-19 20:46:25
祝顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:14 ]
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19楼2012-04-19 20:36:30
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 20:36:30:
1）因为出现这种矛盾又诡异的问题，挑克隆这些低级的错误首先要排除掉呀，但还是建议多挑几个单克隆，平行做一下实验好分析。
2）这种验证方法也是权宜之计，因为你要敲除的ORF(目的片段)800bp，假设还有另一个 ...

恩 我再尝试一下看看 谢谢了！
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20楼2012-04-19 20:46:20
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 20:36:30:
1）因为出现这种矛盾又诡异的问题，挑克隆这些低级的错误首先要排除掉呀，但还是建议多挑几个单克隆，平行做一下实验好分析。
2）这种验证方法也是权宜之计，因为你要敲除的ORF(目的片段)800bp，假设还有另一个 ...

我用载体的引物扩增了突变株的基因组，扩增出来了一个片段从去测序发现敲除载体还存在于我的菌体中，可能是我抗性筛选的时候没筛选好，那我在多传几代再看看
我用的敲除载体是poj260 这种自杀载体在链霉菌里面是不是都是自杀的啊 为什么我都传了6代了他还能在里面呆着啊
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21楼2012-04-21 11:47:59
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
祝实验顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:13 ]
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22楼2012-04-21 16:06:49
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by srlee at 2012-04-21 16:06:49:
那你前面验证PCR出来两种情况就可以解释了：目的基因两侧引物P出来的条带可能来自这个质粒整合到染色体上的片段；目的基因内部的引物P出来的条带可能来自WT，可能你的菌还处于单交换状态。
另，看来你对什么是自 ...

1）如果处于单交换情况，那我目的基因两侧扩出来的片段大小应该是两个5‘同源臂+2个3’同源臂+敲除载体+目的基因长度+目的基因两侧片段，而我扩出来的仅仅是目的基因两侧片段，所以我的菌应该是处于双交换的情况
2)如果是双交换成功了的话那应该是质粒处于游离状态，但我不知道为什么这个质粒在我的菌体里面还能存在，而没有被消除，所以我才有疑问是不是这个自杀质粒在我的那株菌中不是自杀的
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23楼2012-04-21 16:55:47
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
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祝实验顺利！

[ Last edited by srlee on 2012-4-21 at 20:13 ]
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24楼2012-04-21 18:05:56
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by srlee at 2012-04-21 18:05:56:
我是说“可能你的菌还处于单交换状态”，当然这么长的的片段是不容易P出来的，但是为什么PCR会有双交换的条带呢？因为自杀质粒在你的宿主中是不稳定的，就算是通过同源双交换重组上了也是不稳定的，会有一部分从 ...

我设计的突变株扩增引物是设计在两边同源臂外侧的 所以不会是载体上的同源片段
还是谢谢你的热心回复 也祝你实验顺利！
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25楼2012-04-21 20:05:19
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
★
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楼主你好，我想问一下，你做基因敲除的时候两段同源臂之间有抗性筛选标记吗？如果没有，那双交换是如何筛选的呢？谢谢！
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26楼2012-05-18 20:45:30
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by huangdi07 at 2012-05-18 20:45:30:
楼主你好，我想问一下，你做基因敲除的时候两段同源臂之间有抗性筛选标记吗？如果没有，那双交换是如何筛选的呢？谢谢！

就用PCR筛选
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27楼2012-05-19 09:08:41
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huangdi07

铁杆木虫 (小有名气)
★
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27楼: Originally posted by syn1985 at 2012-05-19 09:08:41:
就用PCR筛选

就是说同源臂中间没有抗性标记啊？那无抗筛选得传多少代才可以啊？随机重组概率太低了
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28楼2012-05-19 11:25:22
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txy8469393

木虫 (小有名气)
★
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你如何确定基因敲出以后的phenotype，你有什么证据支持敲掉的这个基因是产生这个产物所必需的。
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29楼2013-10-10 03:54:23
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txy8469393

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
26楼: Originally posted by huangdi07 at 2012-05-18 20:45:30
楼主你好，我想问一下，你做基因敲除的时候两段同源臂之间有抗性筛选标记吗？如果没有，那双交换是如何筛选的呢？谢谢！

single crossover有抗性，double crossover抗性消失。
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30楼2013-10-10 03:56:51
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lovexiang918

新虫 (初入文坛)
★
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楼主您好，我现在做敲除遇到的问题和您遇到的很相似，想问下您是否找到原因了，是怎样解决的？期待您的答复
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31楼2014-02-19 15:15:09
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soochow001

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30楼: Originally posted by txy8469393 at 2013-10-10 03:56:51
single crossover有抗性，double crossover抗性消失。...

请问楼主利用链霉菌的spores可以直接做PCR验证么？ 谢谢！
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32楼2016-02-29 09:50:45
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几何哉

新虫 (初入文坛)
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31楼: Originally posted by lovexiang918 at 2014-02-19 15:15:09
楼主您好，我现在做敲除遇到的问题和您遇到的很相似，想问下您是否找到原因了，是怎样解决的？期待您的答复

楼主，你的问题解决了么，我也遇到了相同的问题
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33楼2018-12-29 14:34:57
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