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syn1985

木虫 (正式写手)

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[交流] 链霉菌基因敲除怪现象

我做链霉菌in frame deletion做了好几个月了这月初用菌落PCR方法检测到了突变株真的好开心然后就发酵 LCMS检测发现产物还在我就觉得很郁闷然后我重新分了单克隆取单克隆的孢子做了菌落PCR PCR检测发现扩增结果比野生小大小和预期的也一样测序结果也是对的可是用目标基因的特异性引物扩增竟然也能扩出目的大小条带这是怎么回事这是我检测手段有问题还是这个菌里面有另一个拷贝啊

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1楼 2012-04-16 14:33:52

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syn1985

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

19楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 20:36:30:
1）因为出现这种矛盾又诡异的问题，挑克隆这些低级的错误首先要排除掉呀，但还是建议多挑几个单克隆，平行做一下实验好分析。
2）这种验证方法也是权宜之计，因为你要敲除的ORF(目的片段)800bp，假设还有另一个 ...

我用载体的引物扩增了突变株的基因组，扩增出来了一个片段从去测序发现敲除载体还存在于我的菌体中，可能是我抗性筛选的时候没筛选好，那我在多传几代再看看
我用的敲除载体是poj260 这种自杀载体在链霉菌里面是不是都是自杀的啊为什么我都传了6代了他还能在里面呆着啊