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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌基因敲除怪现象
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syn1985

木虫 (正式写手)

[交流] 链霉菌基因敲除怪现象

我做链霉菌in frame deletion做了好几个月了 这月初用菌落PCR方法检测到了突变株真的好开心 然后就发酵 LCMS检测发现产物还在 我就觉得很郁闷 然后我重新分了单克隆 取单克隆的孢子做了菌落PCR PCR检测发现扩增结果比野生小 大小和预期的也一样 测序结果也是对的 可是用目标基因的特异性引物扩增竟然也能扩出目的大小条带 这是怎么回事 这是我检测手段有问题还是这个菌里面有另一个拷贝啊
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iijs

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1楼2012-04-16 14:33:52
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
19楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 20:36:30:
1）因为出现这种矛盾又诡异的问题，挑克隆这些低级的错误首先要排除掉呀，但还是建议多挑几个单克隆，平行做一下实验好分析。
2）这种验证方法也是权宜之计，因为你要敲除的ORF(目的片段)800bp，假设还有另一个 ...

我用载体的引物扩增了突变株的基因组，扩增出来了一个片段从去测序发现敲除载体还存在于我的菌体中，可能是我抗性筛选的时候没筛选好，那我在多传几代再看看
我用的敲除载体是poj260 这种自杀载体在链霉菌里面是不是都是自杀的啊 为什么我都传了6代了他还能在里面呆着啊
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21楼2012-04-21 11:47:59
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iijs

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
敲除得多长时间啊
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2楼2012-04-16 15:55:42
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syn1985

木虫 (正式写手)
从构建载体开始到筛到突变株 顺的话2个月吧
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3楼2012-04-16 16:02:20
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
syn1985: 金币+3 2012-04-16 18:41:03
zhang8826857: 金币+3, 分析的有道理 2012-04-16 23:12:32
用目标基因的特异性引物扩增也能扩出目的大小条带，有两种可能：一种可能是非特异性扩增，这个应该好排除，可以通过测序等。另一种可能就是这一个基因在你的这个菌里面有另一个拷贝，当然前提是你要确定你的这个菌是纯的，没有污染（指的是突变株里面混杂有野生型菌株）。希望对你有用。
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4楼2012-04-16 16:56:27
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