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xiajuan9

新虫 (小有名气)

[交流] 链霉菌接合转移 已有7人参与

有哪位前辈知道链霉菌接合转移最关键的是什么?本人做链霉菌,构建好了质粒从大肠杆菌ET12567/pUZ8002带质粒的菌往链霉菌转化,总转不进去,有没有别的更好的方法?该注意什么呢?
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doriscc

金虫 (初入文坛)


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你应该把你做的具体步骤说的详细点,这样可以对症下药。一般整合型的是比较容易的,同源重组的效率会低很多。
2楼2012-06-23 21:14:56
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小小亚杰

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送鲜花一朵
理论上这样做就行了,但根据不同的链霉菌,接合转移程度不同。
3楼2012-06-24 15:55:07
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可以先尝试pSET152载体 ,进行摸索,建立遗传转化体系。一般链霉菌相对容易接合转移...
4楼2012-06-25 06:14:04
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xiajuan9

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by doriscc at 2012-06-23 21:14:56
你应该把你做的具体步骤说的详细点,这样可以对症下药。一般整合型的是比较容易的,同源重组的效率会低很多。

嗯,之前有摸条件,用的是整合型质粒pMT3,能够转进去,虽然效率不高,但是能长出转化子。后来就怎么也转化不成功,尝试过降热激温度降低为42度,15min及45度10min,孢子复苏时间延长6小时以上,甚至换过复苏液。均没效果。怎么办?还可以从哪些方面可以改进呢?
5楼2012-07-04 21:19:00
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doriscc

金虫 (初入文坛)


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孢子的量和大肠杆菌的状态也很重要,OD值最好到0.4,我们做的高一点也没有关系,再把孢子的量提高一些~~祝好
6楼2012-07-05 21:45:45
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果子么么茶

木虫 (著名写手)

★ ★
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zhang8826857: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-06 21:47:14
我做的50℃热激10min 1h内与洗涤好的大肠混匀 涂布 18h后涂萘啶酮酸和抗生素
我觉得涂抗生素的时间也很重要  孢子浓度 大肠浓度很重要
ps 会不会孢子活性不行
7楼2012-07-05 22:01:09
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xiajuan9

新虫 (小有名气)

我用显微镜观察了孢子形态,总觉得没有萌发,热激之后多长时间混匀比较合适呢?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
8楼2012-07-06 21:03:01
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lmhzy1987

金虫 (正式写手)


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引用回帖:
8楼: Originally posted by xiajuan9 at 2012-07-06 21:03:01
我用显微镜观察了孢子形态,总觉得没有萌发,热激之后多长时间混匀比较合适呢?

我个人觉得你孢子没萌发还是孢子不大新鲜的原因,热激通常凉了之后就该混匀了啊
头疼的文库
9楼2012-07-07 14:16:56
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xiajuan9

新虫 (小有名气)

我们老师总说要萌发什么的,费解。还有热激温度问题,

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
10楼2012-07-07 19:38:25
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