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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 链霉菌基因敲除怪现象
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syn1985

木虫 (正式写手)

[交流] 链霉菌基因敲除怪现象

我做链霉菌in frame deletion做了好几个月了 这月初用菌落PCR方法检测到了突变株真的好开心 然后就发酵 LCMS检测发现产物还在 我就觉得很郁闷 然后我重新分了单克隆 取单克隆的孢子做了菌落PCR PCR检测发现扩增结果比野生小 大小和预期的也一样 测序结果也是对的 可是用目标基因的特异性引物扩增竟然也能扩出目的大小条带 这是怎么回事 这是我检测手段有问题还是这个菌里面有另一个拷贝啊
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iijs

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1楼2012-04-16 14:33:52
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by srlee at 2012-04-19 18:14:31:
呵呵，PCR扩增时两个条带分别有多大？敲除的是什么基因？根据表述可能还是没有重组完全，建议再松弛培养一次挑单克隆验证应该就好啦！

PCR扩增时用2种引物 一种是敲除引物 一种是目的基因的orf引物 目的基因片段长度为800左右 以WT为模板敲除引物扩增片段为2000bp左右 去除目的基因后是1200，这些PCR结果和测序结果都正确，菌之前做松弛培养时已经养了4代 然后验证正确后又传了一代 然后再分离了一次单菌落 一共有6代了
重组不完全是什么情况？我这个基因是一个化合物合成的前体合成辅酶A
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15楼2012-04-19 18:28:42
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iijs

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
敲除得多长时间啊
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2楼2012-04-16 15:55:42
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syn1985

木虫 (正式写手)
从构建载体开始到筛到突变株 顺的话2个月吧
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3楼2012-04-16 16:02:20
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
syn1985: 金币+3 2012-04-16 18:41:03
zhang8826857: 金币+3, 分析的有道理 2012-04-16 23:12:32
用目标基因的特异性引物扩增也能扩出目的大小条带，有两种可能：一种可能是非特异性扩增，这个应该好排除，可以通过测序等。另一种可能就是这一个基因在你的这个菌里面有另一个拷贝，当然前提是你要确定你的这个菌是纯的，没有污染（指的是突变株里面混杂有野生型菌株）。希望对你有用。
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4楼2012-04-16 16:56:27
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