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syn1985

木虫 (正式写手)


[交流] 链霉菌基因敲除怪现象

我做链霉菌in frame deletion做了好几个月了 这月初用菌落PCR方法检测到了突变株真的好开心 然后就发酵 LCMS检测发现产物还在 我就觉得很郁闷 然后我重新分了单克隆 取单克隆的孢子做了菌落PCR PCR检测发现扩增结果比野生小 大小和预期的也一样 测序结果也是对的 可是用目标基因的特异性引物扩增竟然也能扩出目的大小条带 这是怎么回事 这是我检测手段有问题还是这个菌里面有另一个拷贝啊
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syn1985

木虫 (正式写手)


引用回帖:
24楼: Originally posted by srlee at 2012-04-21 18:05:56:
我是说“可能你的菌还处于单交换状态”,当然这么长的的片段是不容易P出来的,但是为什么PCR会有双交换的条带呢?因为自杀质粒在你的宿主中是不稳定的,就算是通过同源双交换重组上了也是不稳定的,会有一部分从 ...

我设计的突变株扩增引物是设计在两边同源臂外侧的 所以不会是载体上的同源片段
还是谢谢你的热心回复 也祝你实验顺利!
25楼2012-04-21 20:05:19
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iijs

金虫 (正式写手)


送鲜花一朵
敲除得多长时间啊
2楼2012-04-16 15:55:42
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syn1985

木虫 (正式写手)


从构建载体开始到筛到突变株 顺的话2个月吧
3楼2012-04-16 16:02:20
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zct2008

至尊木虫 (著名写手)


★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
syn1985: 金币+3 2012-04-16 18:41:03
zhang8826857: 金币+3, 分析的有道理 2012-04-16 23:12:32
用目标基因的特异性引物扩增也能扩出目的大小条带,有两种可能:一种可能是非特异性扩增,这个应该好排除,可以通过测序等。另一种可能就是这一个基因在你的这个菌里面有另一个拷贝,当然前提是你要确定你的这个菌是纯的,没有污染(指的是突变株里面混杂有野生型菌株)。希望对你有用。
4楼2012-04-16 16:56:27
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