[交流] 【求助/交流】基因敲除试验

20楼: Originally posted by ouyangxian at 2014-01-16 17:13:20
你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!...

19楼: Originally posted by 黑盖儿 at 2013-10-08 13:27:17
你可以先用PUC18构建自杀质粒，然后转原生质体将自杀质粒导入目标菌株中，然后再提取目标菌株的基因组，做PCR，若结果呈阴性，那就说明敲除成功了，为保险起见，最后送到测序公司一下序列，如果测不出来，那就敲除 ...

Originally posted by 天使托 at 2011-01-23 10:32:30:
你的方法就是插入突变了，给基因中间插入的是什么抗性的片段，只要质粒复制的话，这个抗性基因就可以进行表达，从而达到筛选的目的。楼主做的跟我们实验室做的差不多啊！

[ Last edited by 天使托 on 2011-1- ...

Originally posted by 由田120516 at 2011-01-23 19:36:56:

你的意思就是抗生素抗性基因还是要有自己的启动子，是吧？
我还有个问题，质粒上带的抗生素抗性基因的启动子一定紧靠它的前面吗？有的质粒带有双抗，那它的启动子是一个还是两个？ 谢谢！

Originally posted by 天使托 at 2011-01-23 19:46:49:

他们是各自的启动子，如果两个抗性基因是反向的，那怎么用同一个启动子吗？
其实你大可不必担心启动子的问题，如果这个质粒是没有问题的，那么它的抗性基因肯定也会正常表达，还有一种情况，就是一个质粒上有两 ...

Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 07:56:19:

我做的是基因敲除试验，我只是担心如果我只扩增抗性基因的ORF，那它没有启动子，在新的质粒中能否表达。

Originally posted by 天使托 at 2011-01-24 08:36:04:

这个不是你担心的问题，一般你所用的质粒上面会有相应的抗性基因，这个质粒是人家已经构建好的了，所以放心使用，你要担心的是如何有效的验证你的基因是不是被敲除了！

Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 17:55:05:

不好意思，我可能没说明白。。。我的意思是我要将一个抗生素抗性基因插入到要被敲出的基因的中间，使该基因失活，不能表达蛋白。从而成功构建用于基因敲除的自杀质粒。我想问的是我要插入的这个抗生素抗性基因是 ...

Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 17:55:05:

不好意思，我可能没说明白。。。我的意思是我要将一个抗生素抗性基因插入到要被敲出的基因的中间，使该基因失活，不能表达蛋白。从而成功构建用于基因敲除的自杀质粒。我想问的是我要插入的这个抗生素抗性基因是 ...

Originally posted by 天使托 at 2011-01-24 18:11:40:


肯定需要启动子的，不过一般情况下你插入到基因中间的这段抗性基因一般都可以进行表达的~

Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 20:22:20:

可能我有点啰嗦了。。。我知道如果在atg前面多扩增出100bp肯定有启动子，问题也就解决了。但是我可能有些较真儿，在看过许多文献后发现，他们对于是否加启动子都未做明确说明，有一篇给的还是比较详细，经过分析 ...

13楼: Originally posted by wt3532 at 2011-02-18 16:51:52
我想问问楼主，puc18质粒插入目的基因（中间插入抗性基因）构建自杀质粒，这段基因能够和染色体DNA重组吗，楼主使用的是大肠杆菌还是别的细菌，是不是所有细菌都能用类似的方法敲除基因？
我以前看过的大肠杆菌基因 ...

20楼: Originally posted by ouyangxian at 2014-01-16 17:13:20
你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!...