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由田120516

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】基因敲除试验

我最近在做基因敲除试验，看了很多的文献，有一个问题一直让我很困惑，希望大家帮我解惑，谢谢！
我的方法是首先扩增要敲除的基因的全序列，并将其连接在骨架质粒pUC18的多克隆位点中，然后要将抗生素抗性基因插入到该基因中间，使其失活，从而构建用于基因敲除的自杀质粒。我不明白的是该抗生素抗性基因需要自己的启动子吗，还是它可以利用质粒本身的启动子进行转录翻译？
我看过很多文献，在这一点上都未做详细说明。但经过分析（查看抗生素抗性基因的长度），好像不需要自己的启动子。
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1楼 2011-01-23 09:12:31
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爱笑的眼睛然

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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20楼: Originally posted by ouyangxian at 2014-01-16 17:13:20
你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!...

我对这个问题也很感兴趣，请问解决了吗？
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21楼2014-07-15 15:56:16
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ouyangxian

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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19楼: Originally posted by 黑盖儿 at 2013-10-08 13:27:17
你可以先用PUC18构建自杀质粒，然后转原生质体将自杀质粒导入目标菌株中，然后再提取目标菌株的基因组，做PCR，若结果呈阴性，那就说明敲除成功了，为保险起见，最后送到测序公司一下序列，如果测不出来，那就敲除 ...

你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!
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20楼2014-01-16 17:13:20
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 13:35:07
由田120516(金币+1): 2011-01-23 19:37:52
确切的说，需要

一般都是在抗性基因的atg前面多留100多个碱基~

加抗性基因是后一步了，所以试试看，不行再留长一点。有抗生素筛选，表达了就行
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2楼2011-01-23 09:52:40
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 13:35:12
你的方法就是插入突变了，给基因中间插入的是什么抗性的片段，只要质粒复制的话，这个抗性基因就可以进行表达，从而达到筛选的目的。楼主做的跟我们实验室做的差不多啊！

[ Last edited by 天使托 on 2011-1-23 at 10:33 ]
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3楼2011-01-23 10:32:30
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-23 10:32:30:
你的方法就是插入突变了，给基因中间插入的是什么抗性的片段，只要质粒复制的话，这个抗性基因就可以进行表达，从而达到筛选的目的。楼主做的跟我们实验室做的差不多啊！

[ Last edited by 天使托 on 2011-1- ...

你的意思就是抗生素抗性基因还是要有自己的启动子，是吧？
我还有个问题，质粒上带的抗生素抗性基因的启动子一定紧靠它的前面吗？有的质粒带有双抗，那它的启动子是一个还是两个？ 谢谢！
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4楼2011-01-23 19:36:56
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★ ★
amisking(金币+3): good！ 2011-01-23 19:55:16
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-01-23 19:36:56:

你的意思就是抗生素抗性基因还是要有自己的启动子，是吧？
我还有个问题，质粒上带的抗生素抗性基因的启动子一定紧靠它的前面吗？有的质粒带有双抗，那它的启动子是一个还是两个？ 谢谢！

他们是各自的启动子，如果两个抗性基因是反向的，那怎么用同一个启动子吗？
其实你大可不必担心启动子的问题，如果这个质粒是没有问题的，那么它的抗性基因肯定也会正常表达，还有一种情况，就是一个质粒上有两个抗性基因A和B，在一种菌里是A抗性，但是到了B菌里就是另外一种抗性了！
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5楼2011-01-23 19:46:49
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-23 19:46:49:

他们是各自的启动子，如果两个抗性基因是反向的，那怎么用同一个启动子吗？
其实你大可不必担心启动子的问题，如果这个质粒是没有问题的，那么它的抗性基因肯定也会正常表达，还有一种情况，就是一个质粒上有两 ...

我做的是基因敲除试验，我只是担心如果我只扩增抗性基因的ORF，那它没有启动子，在新的质粒中能否表达。
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6楼2011-01-24 07:56:19
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天使托

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 07:56:19:

我做的是基因敲除试验，我只是担心如果我只扩增抗性基因的ORF，那它没有启动子，在新的质粒中能否表达。

这个不是你担心的问题，一般你所用的质粒上面会有相应的抗性基因，这个质粒是人家已经构建好的了，所以放心使用，你要担心的是如何有效的验证你的基因是不是被敲除了！
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7楼2011-01-24 08:36:04
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-24 08:36:04:

这个不是你担心的问题，一般你所用的质粒上面会有相应的抗性基因，这个质粒是人家已经构建好的了，所以放心使用，你要担心的是如何有效的验证你的基因是不是被敲除了！

不好意思，我可能没说明白。。。我的意思是我要将一个抗生素抗性基因插入到要被敲出的基因的中间，使该基因失活，不能表达蛋白。从而成功构建用于基因敲除的自杀质粒。我想问的是我要插入的这个抗生素抗性基因是否要带有自身的启动子，如果不带的话，在该质粒中能否正常表达。
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8楼2011-01-24 17:55:05
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天使托

专家顾问 (职业作家)
由田120516(金币+1): 2011-01-24 20:14:23
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 17:55:05:

不好意思，我可能没说明白。。。我的意思是我要将一个抗生素抗性基因插入到要被敲出的基因的中间，使该基因失活，不能表达蛋白。从而成功构建用于基因敲除的自杀质粒。我想问的是我要插入的这个抗生素抗性基因是 ...

肯定需要启动子的，不过一般情况下你插入到基因中间的这段抗性基因一般都可以进行表达的~
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9楼2011-01-24 18:11:40
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 17:55:05:

不好意思，我可能没说明白。。。我的意思是我要将一个抗生素抗性基因插入到要被敲出的基因的中间，使该基因失活，不能表达蛋白。从而成功构建用于基因敲除的自杀质粒。我想问的是我要插入的这个抗生素抗性基因是 ...

说了那么多还没搞定啊
atg前100个bp100%有启动子，扩出来啥废话没有，用抗生素筛选去吧
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10楼2011-01-24 18:25:36
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-24 18:11:40:


肯定需要启动子的，不过一般情况下你插入到基因中间的这段抗性基因一般都可以进行表达的~

可能我有点啰嗦了。。。我知道如果在atg前面多扩增出100bp肯定有启动子，问题也就解决了。但是我可能有些较真儿，在看过许多文献后发现，他们对于是否加启动子都未做明确说明，有一篇给的还是比较详细，经过分析他就没用启动子，而是直接将km抗性基因直接插入pUC18中，并且得到表达。
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11楼2011-01-24 20:22:20
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天使托

专家顾问 (职业作家)
由田120516(金币+2): 2011-01-25 10:55:40
引用回帖:
Originally posted by 由田120516 at 2011-01-24 20:22:20:

可能我有点啰嗦了。。。我知道如果在atg前面多扩增出100bp肯定有启动子，问题也就解决了。但是我可能有些较真儿，在看过许多文献后发现，他们对于是否加启动子都未做明确说明，有一篇给的还是比较详细，经过分析 ...

如果不放心的话 最好还是带上启动子比较好！
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12楼2011-01-25 10:52:22
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wt3532

木虫 (著名写手)
我想问问楼主，puc18质粒插入目的基因（中间插入抗性基因）构建自杀质粒，这段基因能够和染色体DNA重组吗，楼主使用的是大肠杆菌还是别的细菌，是不是所有细菌都能用类似的方法敲除基因？
我以前看过的大肠杆菌基因敲除要用的三个质粒，不知道楼主基因敲除成功没有，敲除后怎样鉴定敲除成功。
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13楼2011-02-18 16:51:52
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2008116068

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
抗生素有自己的启动子
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14楼2011-12-03 17:31:57
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hyacinth326

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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zhang8826857(金币+5): 鼓励交流 2012-01-09 23:33:59
这么说吧，如果你想不用抗性基因上的启动子的话，可以，但是一定与你要敲除的那个基因保持相同的读码框，就是别移码，此时，你是依靠你所要敲除的那个基因的启动子，表达的是一个融合蛋白。如果抗性基因有自己的启动子最好，因为启动子与起始密码子的距离也会影响转录水平的，这样是最保险的做法。
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15楼2012-01-09 22:12:57
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fang-1

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
是要带自己的启动子的，所以等基因敲除后可能后片段自连，自己表达抗生素，从而出现假阳性，但这个概率不是很大，我的自己加了启动子
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16楼2012-03-09 10:40:40
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lyyjackey

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
个人觉得是需要带上启动子的。。。
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17楼2013-05-24 14:29:05
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cheney00

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你会发现抗性基因ORF前面还有一段序列。里边就有抗性基因自身的promoter
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18楼2013-10-06 11:44:07
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
13楼: Originally posted by wt3532 at 2011-02-18 16:51:52
我想问问楼主，puc18质粒插入目的基因（中间插入抗性基因）构建自杀质粒，这段基因能够和染色体DNA重组吗，楼主使用的是大肠杆菌还是别的细菌，是不是所有细菌都能用类似的方法敲除基因？
我以前看过的大肠杆菌基因 ...

你可以先用PUC18构建自杀质粒，然后转原生质体将自杀质粒导入目标菌株中，然后再提取目标菌株的基因组，做PCR，若结果呈阴性，那就说明敲除成功了，为保险起见，最后送到测序公司一下序列，如果测不出来，那就敲除成功了。
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19楼2013-10-08 13:27:17
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鱼虾水中游

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
20楼: Originally posted by ouyangxian at 2014-01-16 17:13:20
你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!...

你好！请问你的问题解决了嘛？我现在也遇到了同样的问题！原因是什么？如何解决？谢谢！
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22楼2016-04-27 17:37:18
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ouyangxian

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一种情况是只是单链敲除了，双链敲除可能致死；另一种情况是技术本身的问题，重新构建，多挑几个克隆，总有一个是对的。
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23楼2016-04-28 08:23:39
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嗅歪歪啦

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问一下抗生素抗性基因如何选取和插入呢
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24楼2017-08-26 12:27:06
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