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由田120516

新虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】基因敲除试验

我最近在做基因敲除试验，看了很多的文献，有一个问题一直让我很困惑，希望大家帮我解惑，谢谢！
我的方法是首先扩增要敲除的基因的全序列，并将其连接在骨架质粒pUC18的多克隆位点中，然后要将抗生素抗性基因插入到该基因中间，使其失活，从而构建用于基因敲除的自杀质粒。我不明白的是该抗生素抗性基因需要自己的启动子吗，还是它可以利用质粒本身的启动子进行转录翻译？
我看过很多文献，在这一点上都未做详细说明。但经过分析（查看抗生素抗性基因的长度），好像不需要自己的启动子。

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1楼 2011-01-23 09:12:31

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ouyangxian

新虫 (小有名气)

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引用回帖:

19楼: Originally posted by 黑盖儿 at 2013-10-08 13:27:17
你可以先用PUC18构建自杀质粒，然后转原生质体将自杀质粒导入目标菌株中，然后再提取目标菌株的基因组，做PCR，若结果呈阴性，那就说明敲除成功了，为保险起见，最后送到测序公司一下序列，如果测不出来，那就敲除 ...

你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!