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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因敲除试验
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由田120516

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】基因敲除试验

我最近在做基因敲除试验，看了很多的文献，有一个问题一直让我很困惑，希望大家帮我解惑，谢谢！
我的方法是首先扩增要敲除的基因的全序列，并将其连接在骨架质粒pUC18的多克隆位点中，然后要将抗生素抗性基因插入到该基因中间，使其失活，从而构建用于基因敲除的自杀质粒。我不明白的是该抗生素抗性基因需要自己的启动子吗，还是它可以利用质粒本身的启动子进行转录翻译？
我看过很多文献，在这一点上都未做详细说明。但经过分析（查看抗生素抗性基因的长度），好像不需要自己的启动子。
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1楼 2011-01-23 09:12:31
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ouyangxian

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by 黑盖儿 at 2013-10-08 13:27:17
你可以先用PUC18构建自杀质粒，然后转原生质体将自杀质粒导入目标菌株中，然后再提取目标菌株的基因组，做PCR，若结果呈阴性，那就说明敲除成功了，为保险起见，最后送到测序公司一下序列，如果测不出来，那就敲除 ...

你好！我也是做细菌基因敲除的，敲除后用PCR扩增，检测不到目的片段，测序也没有问题，可是做Western blot却能检测到目的蛋白，请问你有遇到过着情况吗？原因是啥？如何解决？谢谢!
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20楼2014-01-16 17:13:20
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 13:35:07
由田120516(金币+1): 2011-01-23 19:37:52
确切的说，需要

一般都是在抗性基因的atg前面多留100多个碱基~

加抗性基因是后一步了，所以试试看，不行再留长一点。有抗生素筛选，表达了就行
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2楼2011-01-23 09:52:40
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-23 13:35:12
你的方法就是插入突变了，给基因中间插入的是什么抗性的片段，只要质粒复制的话，这个抗性基因就可以进行表达，从而达到筛选的目的。楼主做的跟我们实验室做的差不多啊！

[ Last edited by 天使托 on 2011-1-23 at 10:33 ]
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3楼2011-01-23 10:32:30
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由田120516

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-23 10:32:30:
你的方法就是插入突变了，给基因中间插入的是什么抗性的片段，只要质粒复制的话，这个抗性基因就可以进行表达，从而达到筛选的目的。楼主做的跟我们实验室做的差不多啊！

[ Last edited by 天使托 on 2011-1- ...

你的意思就是抗生素抗性基因还是要有自己的启动子，是吧？
我还有个问题，质粒上带的抗生素抗性基因的启动子一定紧靠它的前面吗？有的质粒带有双抗，那它的启动子是一个还是两个？ 谢谢！
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4楼2011-01-23 19:36:56
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