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flyhbsa002

新虫 (小有名气)

[求助] 如何做同源重组

本人初涉基因敲除，请教各位大侠！
我要做丝状真菌基因敲除，可是这个基因序列未知（1200bp），我只扩到了五百多个bp的保守序列，也用TALE-PCR扩增了其侧翼序列了，但只扩到了850bp.想问问大家 ，可以用这850bp片段直接做敲除吗？同源臂有什么要求啊？
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1楼 2011-09-10 20:37:08
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助。 2011-09-10 23:12:04
wanhscn(金币+3): good，鼓励继续交流 2011-09-11 08:16:08
基因片段太短，直接敲除有点困难。
同源重组频率与交换片段的长度有关，一般说来，同源臂的长度应不短于 500 bp，且两同源臂的长度应大致相等，否则会对双交换菌株的筛选造成困难。
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2楼2011-09-10 21:01:08
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flyhbsa002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-10 21:01:08:
基因片段太短，直接敲除有点困难。
同源重组频率与交换片段的长度有关，一般说来，同源臂的长度应不短于 500 bp，且两同源臂的长度应大致相等，否则会对双交换菌株的筛选造成困难。

没有扩增到启动子和终止子的话可以做敲除吗？
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3楼2011-09-10 21:12:23
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-11 16:20:19
flyhbsa002(金币+5): 谢谢！ 2011-09-14 09:05:58
做敲除是可以的，但是后面如果要排除因为极性或是自发突变而产生的情况下，要做遗传互补，这时候就要克隆整个基因出来，把构建表达载体，重新把你敲除掉的基因表达出来，所以基因必须要拿到完整的。启动子和终止子没有扩增到是可以做基因敲除的。
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4楼2011-09-11 11:07:55
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flyhbsa002

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-11 11:07:55:
做敲除是可以的，但是后面如果要排除因为极性或是自发突变而产生的情况下，要做遗传互补，这时候就要克隆整个基因出来，把构建表达载体，重新把你敲除掉的基因表达出来，所以基因必须要拿到完整的。启动子和终止子 ...

如果我只是想让这个基因失活的话，就不用扩增到完整的基因了吧？
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5楼2011-09-14 09:07:12
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


flyhbsa002(金币+5): 嘿嘿！ 2011-09-14 09:25:00
之前阻断时可以不用扩增完整基因，但是你后续试验中要做遗传互补，以排除极性效应或自发突变的情况，以确保是基因被阻断后产生的影响，因此要做遗传互补，这时就需要把整个完整的基因给导回到基因阻断突变株中表达，以排除别的原因，所以，后面需要一个表达载体，所以完整的基因也是要扩的。
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flyhbsa002
6楼2011-09-14 09:14:52
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flyhbsa002

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 瓶儿花 at 2011-09-14 09:14:52:
之前阻断时可以不用扩增完整基因，但是你后续试验中要做遗传互补，以排除极性效应或自发突变的情况，以确保是基因被阻断后产生的影响，因此要做遗传互补，这时就需要把整个完整的基因给导回到基因阻断突变株中表达 ...

哦哦，明白了，谢谢指导！
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7楼2011-09-14 09:24:28
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