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xiangquanju

金虫 (小有名气)

[求助] 做过用同源重组进行基因敲出的朋友请进，PCR做不出来！！

利用同源重组的原理，打算敲掉大肠杆菌的一个基因，以pKD4为模板，打算扩增一段带有卡那霉素抗性基因的片段，作为重组筛选的标记。
上下游引物均有70bp，其中20bp是和质粒模板互补的，其余50bp是和基因组上欲敲除的基因互补的。与质粒互补的20bp，Tm值分别为47和60，PCR一直都只有引物带，退火温度从30--50度都试过了，也尝试了pfu和KOD聚合酶，都没什么改进
所以恳请做过类似实验的虫友指点指点
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1楼 2011-11-21 01:18:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhl4312

银虫 (初入文坛)
楼主：你好我也正准备采用RED同源重组做基因敲除，请问质粒pkD4和PKD46在哪买的？
谢谢！
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一切伟大的行动和思想，都有一个微不足道的开始！不论你在什么时候开始，重要的是开始之后不要停止；不论你在什么时候结束，重要的是结束之后不要悔恨！
10楼2012-02-13 11:06:25
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普通回帖

凡子1985

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-21 18:36:55
xiangquanju(金币+5): 2011-11-21 19:44:41
这种PCR一定要注意 主要问题出在模版浓度上 还有问题出现在退火温度上 退火温度选择55°最为保险 主要考虑模版浓度吧  我们是实验室最常做的就是酵母基因的敲除  用的就是这种方法  百试不爽
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2楼2011-11-21 02:48:41
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zhqsun2006

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励积极应助！ 2011-11-21 18:37:06
不知道你上下游片段与marker基因怎么连接的，如果是3个片段通过搭桥PCR连接的话，两边互补区域的退火温度差别不要太大了，用pfu可以把延伸时间设长点，我连接3个片段的时候2300bp延伸时间设了2min才把目的带扩出来，不好解释的。如果是其他的方法，就再多问问查查吧。
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3楼2011-11-21 11:43:12
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-21 02:48:41:
这种PCR一定要注意 主要问题出在模版浓度上 还有问题出现在退火温度上 退火温度选择55°最为保险 主要考虑模版浓度吧  我们是实验室最常做的就是酵母基因的敲除  用的就是这种方法  百试不爽

谢谢，你的意思是在模板浓度上也应该设置梯度么！！
我之前也没做过，本来想着是从质粒上进行扩增，应该非常容易，结果都捣鼓了两周了，都没进展
你能详细给我说一下么，比如说一半用什么酶，模板浓度大概多少，其实我也有试过，质粒不稀释以及稀释50倍来做模板，质粒不稀释，50ul全部电泳，能看到非常微弱的带，我把条带切下来做第二轮PCR的模板，结果没有扩增出来
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4楼2011-11-21 19:40:04
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhqsun2006 at 2011-11-21 11:43:12:
不知道你上下游片段与marker基因怎么连接的，如果是3个片段通过搭桥PCR连接的话，两边互补区域的退火温度差别不要太大了，用pfu可以把延伸时间设长点，我连接3个片段的时候2300bp延伸时间设了2min才把目的带扩出来 ...

不是与marker基因链接啊，我现在是想从质粒上扩增一段marker基因，但是扩增的引物有70bp，其中20bp是和模板，也就是质粒互补的，可能多于的50bp的引物形成了一些干扰因素
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5楼2011-11-21 19:46:53
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凡子1985

银虫 (小有名气)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-11-21 23:42:44
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiangquanju at 2011-11-21 19:40:04:
谢谢，你的意思是在模板浓度上也应该设置梯度么！！
我之前也没做过，本来想着是从质粒上进行扩增，应该非常容易，结果都捣鼓了两周了，都没进展
你能详细给我说一下么，比如说一半用什么酶，模板浓度大概多少 ...

注意可能是质粒的条带哦  别搞错了 就是质粒浓度太高容易影响PCR 我们用的是phusion酶  KOD也好
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6楼2011-11-21 20:01:35
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小白虾

木虫 (正式写手)
我用PCR验证 长度为2300bp 模板浓度及退火要做好
应该没啥问题
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飞的更高
7楼2011-11-22 11:23:45
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
我用taq酶设置的梯度，从35到60，都扩增出来了，只是还在犹豫产物是否可以用，我再优化一些PCR体系吧
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8楼2011-11-22 20:16:17
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zhqsun2006

金虫 (初入文坛)
这么长的引物，我目前还没用过，没啥经验啊！
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9楼2011-11-24 11:18:43
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