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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

[求助] 做过用同源重组进行基因敲出的朋友请进,PCR做不出来!!

利用同源重组的原理,打算敲掉大肠杆菌的一个基因,以pKD4为模板,打算扩增一段带有卡那霉素抗性基因的片段,作为重组筛选的标记。
上下游引物均有70bp,其中20bp是和质粒模板互补的,其余50bp是和基因组上欲敲除的基因互补的。与质粒互补的20bp,Tm值分别为47和60,PCR一直都只有引物带,退火温度从30--50度都试过了,也尝试了pfu和KOD聚合酶,都没什么改进
所以恳请做过类似实验的虫友指点指点
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zhl4312

银虫 (初入文坛)

楼主:你好我也正准备采用RED同源重组做基因敲除,请问质粒pkD4和PKD46在哪买的?
谢谢!
一切伟大的行动和思想,都有一个微不足道的开始!不论你在什么时候开始,重要的是开始之后不要停止;不论你在什么时候结束,重要的是结束之后不要悔恨!
10楼2012-02-13 11:06:25
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普通回帖

凡子1985

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-21 18:36:55
xiangquanju(金币+5): 2011-11-21 19:44:41
这种PCR一定要注意 主要问题出在模版浓度上 还有问题出现在退火温度上 退火温度选择55°最为保险 主要考虑模版浓度吧  我们是实验室最常做的就是酵母基因的敲除  用的就是这种方法  百试不爽
2楼2011-11-21 02:48:41
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zhqsun2006

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励积极应助! 2011-11-21 18:37:06
不知道你上下游片段与marker基因怎么连接的,如果是3个片段通过搭桥PCR连接的话,两边互补区域的退火温度差别不要太大了,用pfu可以把延伸时间设长点,我连接3个片段的时候2300bp延伸时间设了2min才把目的带扩出来,不好解释的。如果是其他的方法,就再多问问查查吧。
3楼2011-11-21 11:43:12
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 凡子1985 at 2011-11-21 02:48:41:
这种PCR一定要注意 主要问题出在模版浓度上 还有问题出现在退火温度上 退火温度选择55°最为保险 主要考虑模版浓度吧  我们是实验室最常做的就是酵母基因的敲除  用的就是这种方法  百试不爽

谢谢,你的意思是在模板浓度上也应该设置梯度么!!
我之前也没做过,本来想着是从质粒上进行扩增,应该非常容易,结果都捣鼓了两周了,都没进展
你能详细给我说一下么,比如说一半用什么酶,模板浓度大概多少,其实我也有试过,质粒不稀释以及稀释50倍来做模板,质粒不稀释,50ul全部电泳,能看到非常微弱的带,我把条带切下来做第二轮PCR的模板,结果没有扩增出来
4楼2011-11-21 19:40:04
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhqsun2006 at 2011-11-21 11:43:12:
不知道你上下游片段与marker基因怎么连接的,如果是3个片段通过搭桥PCR连接的话,两边互补区域的退火温度差别不要太大了,用pfu可以把延伸时间设长点,我连接3个片段的时候2300bp延伸时间设了2min才把目的带扩出来 ...

不是与marker基因链接啊,我现在是想从质粒上扩增一段marker基因,但是扩增的引物有70bp,其中20bp是和模板,也就是质粒互补的,可能多于的50bp的引物形成了一些干扰因素
5楼2011-11-21 19:46:53
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凡子1985

银虫 (小有名气)


西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-11-21 23:42:44
引用回帖:
4楼: Originally posted by xiangquanju at 2011-11-21 19:40:04:
谢谢,你的意思是在模板浓度上也应该设置梯度么!!
我之前也没做过,本来想着是从质粒上进行扩增,应该非常容易,结果都捣鼓了两周了,都没进展
你能详细给我说一下么,比如说一半用什么酶,模板浓度大概多少 ...

注意可能是质粒的条带哦  别搞错了 就是质粒浓度太高容易影响PCR 我们用的是phusion酶  KOD也好
6楼2011-11-21 20:01:35
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小白虾

木虫 (正式写手)

我用PCR验证 长度为2300bp 模板浓度及退火要做好
应该没啥问题
飞的更高
7楼2011-11-22 11:23:45
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

我用taq酶设置的梯度,从35到60,都扩增出来了,只是还在犹豫产物是否可以用,我再优化一些PCR体系吧
8楼2011-11-22 20:16:17
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zhqsun2006

金虫 (初入文坛)

这么长的引物,我目前还没用过,没啥经验啊!
9楼2011-11-24 11:18:43
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