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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助，做不出来找不到原因
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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR求助，做不出来找不到原因 已有4人参与

做了两个多周的PCR了，非常郁闷。是以霉菌基因组为模板做PCR的。共设计了四对引物，PCR三个基因。（其中有一对引物是PCR基因加上它上下游的）。发现都没有目的带。

1，模板质量应该没问题，跑过电泳，电泳大小在12K左右；OD600：OD800=1.81
2，引物设计，用Primer Premier设计的，有三组引物得分很高，与模板配对的引物长度为17~~20bp
3，PCR酶，DNTP，buffer没问题。用其他模板引物做过阳性对照，所以PCR得不到目的片段肯定是模板或引物的问题。

PCR产物杂带很多，曾经对大小差不多的条带回收酶切验证，仍然得不到目的基因。是不是还是引物的问题？我应该如何设计下一阶段的实验方案？

谢谢！
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1楼 2010-10-26 09:22:02
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 10:55:09
前面很乱，也没理出头绪，但是杂带很多肯定是温度不对了，先升高温度看看，如果是弥散的那种那可能是模板浓度太大了
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2楼2010-10-26 09:51:53
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 10:55:24
1   用已知序列设计引物还是近缘序列设计引物

2   不同pcr退火温度  dntp用量 延伸温度都不一样。 你的对照如何做的。

3   既然有序列报道 尝试用报道序列提供的引物
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3楼2010-10-26 09:57:03
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 09:51:53:
前面很乱，也没理出头绪，但是杂带很多肯定是温度不对了，先升高温度看看，如果是弥散的那种那可能是模板浓度太大了

谢谢！

做过温度梯度和模板浓度梯度。
温度再高就P不出了，
模板浓度稀释后，影响不大，目的带大小的条带还是很弱，杂带还是很多。
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4楼2010-10-26 10:32:30
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-10-26 09:57:03:
1   用已知序列设计引物还是近缘序列设计引物

2   不同pcr退火温度  dntp用量 延伸温度都不一样。 你的对照如何做的。

3   既然有序列报道 尝试用报道序列提供的引物

谢谢！
1， 已知序列
2， 以TM值低5℃开始，2℃为梯度，做过退火温度梯度；用的是Takara 的pyrobest，20ul体系用1.6ul dntp； 延伸温度是72℃。做过模板浓度的摸索。对照是用大肠基因组和相应引物做的，PCR体系应该没问题。
3，这个基因是基因组分析时预测的基因，文献报导还没有人P过。

非常感谢您的热心解答！
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5楼2010-10-26 10:36:40
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amilie030312

金虫 (正式写手)
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1949stone(金币+2):是的 有道理 2010-10-26 18:55:11
那肯定是引物不行了，如果有经过证实的引物了那就用现成的吧。只需要摸摸退火温度就行了。
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6楼2010-10-26 10:48:04
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ap

金虫 (正式写手)
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Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 10:48:04:
那肯定是引物不行了，如果有经过证实的引物了那就用现成的吧。只需要摸摸退火温度就行了。

我再订别的引物试试。
菌种是别人给我的，我怀疑是不是菌种给错了啊，四个引物都P不出来。
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7楼2010-10-26 11:00:28
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by ap at 2010-10-26 11:00:28:


我再订别的引物试试。
菌种是别人给我的，我怀疑是不是菌种给错了啊，四个引物都P不出来。

菌给错了的可能性不大吧，这样就太神奇了
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8楼2010-10-26 12:11:08
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 12:11:08:

菌给错了的可能性不大吧，这样就太神奇了

以前设计的引物是用Primer premier5设计的，得分都挺高啊。可是就是杂带很多，没有目的带
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9楼2010-10-26 12:49:15
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 12:11:08:

菌给错了的可能性不大吧，这样就太神奇了

因为我的目的基因的序列的原因，卡着我的目的基因设计引物，得分都很低。我想在目的基因上下游设计引物，得到“目的基因+上下游片段”后，再以它为模板PCR这样可行吗？
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10楼2010-10-26 12:58:35
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