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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR问题求助
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star1987

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR问题求助

请教高手一个问题，我做PCR的时候用上海生工DNA Taq polymerase（红盖子的）（退火温度梯度从45度到65度）都能P出来，而且条带很亮，但是用LA Taq polymerase、Ex Taq polymerase和Prime Star都P不出来。这是什么原因？
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1楼 2010-12-21 15:28:59
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star1987

木虫 (著名写手)
amisking:这样是不对的。 2010-12-21 20:32:41
自己沙发
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2楼2010-12-21 16:01:23
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
star1987(金币+1):谢谢 2010-12-21 16:21:28
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:07:20
不同的酶，条件有所不同吧。这种情况我也碰到过，当时是提高了退火温度
普通taq，好像比较容易P出来，高保真的没那么简单。当时师兄这样解释给我听
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3楼2010-12-21 16:11:55
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star1987

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-21 16:11:55:
不同的酶，条件有所不同吧。这种情况我也碰到过，当时是提高了退火温度
普通taq，好像比较容易P出来，高保真的没那么简单。当时师兄这样解释给我听

不同的酶条件是不一样，但我用高保真的酶也做了温度梯度，还是P不出来。
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4楼2010-12-21 16:21:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)
其实有时就是这样的情况，所以建议一直用一个公司的一种酶！
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5楼2010-12-21 16:23:26
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★
star1987(金币+1): 2010-12-21 16:50:00
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:07:37
高保真的酶有着其特殊性，保真性能高了，PCR效率就会低，同样的条件肯定不行。
我拿Prime Star来说吧，这个我用的多些。
普通的Taq，退火时间一般为30s，但是这个酶就比较特殊，退火时间10s，我扩增3k的片段照样退火10s，这时候如果你用普通程序肯定做不出来。
建议好好研究一下各个酶的说明书，你会有很大收获的，呵呵，好运
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6楼2010-12-21 16:28:56
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star1987

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2010-12-21 16:28:56:
高保真的酶有着其特殊性，保真性能高了，PCR效率就会低，同样的条件肯定不行。
我拿Prime Star来说吧，这个我用的多些。
普通的Taq，退火时间一般为30s，但是这个酶就比较特殊，退火时间10s，我扩增3k的片段照样 ...

我都是按照每个酶的说明书做的，仍然谢谢你！
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7楼2010-12-21 16:49:39
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star1987

木虫 (著名写手)
继续求助高手来解答！
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8楼2010-12-21 16:50:56
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Michael008

新虫 (初入文坛)
做鉴定还是克隆？如果从基因组P效率会很不稳定，会不会你后来的模板有问题？
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9楼2010-12-21 19:21:59
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star1987

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Michael008 at 2010-12-21 19:21:59:
做鉴定还是克隆？如果从基因组P效率会很不稳定，会不会你后来的模板有问题？

做克隆，应该不会的，模板是刚提的。
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10楼2010-12-21 19:55:18
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Michael008

新虫 (初入文坛)
star1987(金币+1): 2010-12-21 20:25:14
模板是基因组吗？
既然上次P出来过，有留底就好了，效率肯定能保证。
实在不行换PCR MIX试试，做克隆巨爽。
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11楼2010-12-21 20:01:43
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超然渡陈之家

新虫 (初入文坛)
我也遇到了同样的问题，现在还在纠结。我是提RNA反转录成一链后作为模版扩基因。LA Taq很容易就扩出来了，但是有突变，改用高保真酶后做梯度一直不出带。望高手指点啊！
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12楼2010-12-21 20:20:18
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star1987

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by Michael008 at 2010-12-21 20:01:43:
模板是基因组吗？
既然上次P出来过，有留底就好了，效率肯定能保证。
实在不行换PCR MIX试试，做克隆巨爽。

模板是基因组。关键是高保真的酶P不出来。谢谢！
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13楼2010-12-21 20:24:37
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by star1987 at 2010-12-21 15:28:59:
请教高手一个问题，我做PCR的时候用上海生工DNA Taq polymerase（红盖子的）（退火温度梯度从45度到65度）都能P出来，而且条带很亮，但是用LA Taq polymerase、Ex Taq polymerase和Prime Star都P不出来。这是什么 ...

楼主做的是平行试验么？用同样的模板（同一个DNA样品）做模板，不同的酶做的PCR么？最好上一个模板DNA的图，大家研究研究
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14楼2010-12-21 22:10:43
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star1987

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2010-12-21 22:10:43:


楼主做的是平行试验么？用同样的模板（同一个DNA样品）做模板，不同的酶做的PCR么？最好上一个模板DNA的图，大家研究研究

是平行试验，模板序列如下：
ATGTGTTCTTCAATGACAATTAAATCGCTACAAGGTGATATTTTCTGGGGCCGGACCATGGATTACAACACCAGTTTCTTTCATGAATCACCAGTCGGCGGGGTTCCTGGTAAAATTGTCAGTTTGCCAGCAAACAAGGCATTACCAACACAAAGTGCCAAATGGACCACAAAGTATGCAGCGGTTGGCGTCGGTATTGATCAAAGTACGGCACTTTTCGACGGCGTCAATAGCGAAGGCTTGGCTGGCGACTTGCAGGTTTTGGTAGAGTGCAGCTGGGCGAGTGCGGATTCTTTGAAACAGCGTGGGCTGAAAGCTATTAAAGGCGAGGAGTTTGTGACCTTGGCCTTGACGACATGCAAAAATGTTGACGAAGTACGCGCTTTGGCGGGTGAGTATGGCCTGCTGGATGAACCTTATGAGTTTGGCGGCCAAGGGGTGAAAATCCCATTACATTACACATTTGTTGATCCATCAGGTAAGGGGATTGTTGTCGAACCAACCGATCACGGCGCCTTTAAGCTGTATGATAGCATCGGCGCCATGACGAATAGTCCTGAATACGGGTGGCATGAAACCAATTTGCGCAATTATGTCAGTCTGAATGACAATAACTATCCTAAGGGGTCCGAATTAGGCGACTACCATATTGAGCCGATTGAGTTAGGCACAGGCTACGGGATGTTCGGTTTGCCAGGCGATTACACATCACCATCGCGGTTTCTGCGGGCAATGTTTGTTTCGCGTAATCTTGATCCCTTCAATAGCAAAGACGGCATTCGCGTATTATACAATGCTTTCAAGACTGTCTTGATTCCGCAGGGGCTAGGTCGCGACCCACAACATCAGGTTTTAACGGATTACACGCAGTACTGGTCTGGCTATGATCTGACGAAAAAGACAATTTTCGTGCAAGATTCAGACACATTGACAATGACAACGAAAACACTTGATCCGACTATTACTGACGTCACTTATGAAGATTTGGCTAAAACTGAACAGTTCAATCAACTGTAG
上游引物：CGGGATCCGATGTGTTCTTCAATGACAATTAAATCGC
下游引物：CCCAAGCTTCTACAGTTGATTGAACTGTTCAGTTTTAGC
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15楼2010-12-21 23:16:15
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★
silicare(金币+2):谢谢参与 2010-12-22 11:53:10
star1987(金币+2):谢谢 2010-12-24 16:33:45
引用回帖:
Originally posted by star1987 at 2010-12-21 23:16:15:

是平行试验，模板序列如下：
ATGTGTTCTTCAATGACAATTAAATCGCTACAAGGTGATATTTTCTGGGGCCGGACCATGGATTACAACACCAGTTTCTTTCATGAATCACCAGTCGGCGGGGTTCCTGGTAAAATTGTCAGTTTGCCAGCAAACAAGGCATTACCAACACAAAGTGCCAAATGGAC ...

刚才分析了一下这个序列的限制酶切点。有这样一个办法，楼主多提一些模板DNA（基因组），浓缩纯化，然后用EcoRI或者HindIII消化模板DNA，也可两种酶一起消化。目的是使模板变小，容易和引物结合。然后再做PCR。你试试看
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16楼2010-12-22 04:14:56
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zhfb.619

铜虫 (初入文坛)
我觉得４楼和５楼的说法，你最好选定一家公司的产品，而且好好研究下他们的说明书吧
相信总会找到问题答案的
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17楼2010-12-22 09:45:21
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adslye

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 超然渡陈之家 at 2010-12-21 20:20:18:
我也遇到了同样的问题，现在还在纠结。我是提RNA反转录成一链后作为模版扩基因。LA Taq很容易就扩出来了，但是有突变，改用高保真酶后做梯度一直不出带。望高手指点啊！

LA就是高保真酶吧？ 突变其实很少的，你可以多试几次。总之，我用LA构建载体很少很少极少有突变~~~
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18楼2010-12-22 10:44:30
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adslye

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
silicare(金币+3):很热心的说~ 2010-12-22 11:53:29
star1987(金币+2):非常感谢！ 2010-12-24 16:34:58
引用回帖:
Originally posted by star1987 at 2010-12-21 20:24:37:

模板是基因组。关键是高保真的酶P不出来。谢谢！

基因组最好要酶切~生工的酶的确效率很高，但有时候P出的那是啥啊！不敢恭维~~
我最近也是再做这个，恰好酶用的和你一样，生工，TAKARA LA, 还有一个2Xmix的。

因为，我是基因组酶切后P的，所以都能P出来，我这的问题是2K以上的片段只能LA来P。

总之我的建议是：
1，确定你的基因组的纯化做的OK，没有酚什么残留。
2， 如果你还用基因组P，那就稀释下做模板。
3，强烈建议酶切乙醇纯化后再P。5,6个识别碱基的酶都可以~
4，确定生工P出来的东西是对的,可能就是假阳性，那个效率太高的东西不一定可靠。
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19楼2010-12-22 10:50:39
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wangy0908

金虫 (正式写手)
期待答案，遇到类似的问题了，正在愁呢
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20楼2010-12-22 11:56:54
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-12-22 10:50:39:


基因组最好要酶切~生工的酶的确效率很高，但有时候P出的那是啥啊！不敢恭维~~
我最近也是再做这个，恰好酶用的和你一样，生工，TAKARA LA, 还有一个2Xmix的。

因为，我是基因组酶切后P的，所以都能P出来， ...

我想问过初级的问题，酶切后P与酶切前P有什么区别的呢？？是模板接触的程度有关还是什么的呢？另外，就是怎样判断你要P的区域是否有酶切位点？因为如果有酶切位点的话，也P不出来的啊。因为我做的是小麦的基因组，没有被测序出来！
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21楼2010-12-22 12:03:59
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-22 11:56:54:
期待答案，遇到类似的问题了，正在愁呢

请看我15楼的回复
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22楼2010-12-22 14:25:50
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-22 12:03:59:

我想问过初级的问题，酶切后P与酶切前P有什么区别的呢？？是模板接触的程度有关还是什么的呢？另外，就是怎样判断你要P的区域是否有酶切位点？因为如果有酶切位点的话，也P不出来的啊。因为我做的是小麦的基因 ...

请看我15楼的回复
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23楼2010-12-22 14:26:36
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adslye

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-12-22 12:03:59:

我想问过初级的问题，酶切后P与酶切前P有什么区别的呢？？是模板接触的程度有关还是什么的呢？另外，就是怎样判断你要P的区域是否有酶切位点？因为如果有酶切位点的话，也P不出来的啊。因为我做的是小麦的基因 ...

这个为啥基因组要酶切，我没有资料给你。我也是被口传口教授的。但可以想象下~~~空间上的关系~~不过，我偶尔偷懒用基因组直接P都能P出来。
另外至于酶切位点，除非你人品灰常差，否则应该没问题。5个识别位点的切点平均4的5次方才出现一个~当然不排除个别序列的特殊情况。

我想问你下，你如何确定你的引物一定能P出条带，既然你的目的条带未知。
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24楼2010-12-22 15:46:13
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最爱花诗雨

金虫 (正式写手)
单就酶来讲也许很难搞懂，不过，既然你用上海生工DNA Taq polymerase能P出来，干嘛还要用其他的酶做呢？不同公司的酶和他们用的缓冲液等都或多或少有影响的
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25楼2010-12-22 16:22:05
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star1987

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 最爱花诗雨 at 2010-12-22 16:22:05:
单就酶来讲也许很难搞懂，不过，既然你用上海生工DNA Taq polymerase能P出来，干嘛还要用其他的酶做呢？不同公司的酶和他们用的缓冲液等都或多或少有影响的

上海生工DNA Taq polymerase不是高保真的酶，会引起突变的。
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26楼2010-12-24 16:39:09
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zrr807

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
可以尝试一下降低退火温度
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27楼2011-11-06 21:23:21
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yimi6035

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
高保真酶对条件要求很精确的，你如果不需要高保真，用tap就行啊
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28楼2011-11-07 11:22:27
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