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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解PCR问题《忘记加水的前后》
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高照李

木虫 (正式写手)

[求助] 求解PCR问题《忘记加水的前后》

我要扩增昆虫线粒体DNA的一个片段，前天做退火温度的梯度PCR实验时时侯忙中出错忘记加水了（需定容至50微升），扩出的结果用琼脂糖凝胶电泳检测时发现有3 个温度的样本有片段（40-52度的梯度，41.6度、48度和50度的有，41.6度的最亮），且和需要的大小相近，其它温度的样本则没有扩出。我又重新做了一遍退火温度的梯度PCR（所有试剂都加好了无遗漏），但什么也没出。
      请问这是什么原因？请问哪位大侠知道。
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1楼 2012-11-22 19:54:18
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回帖置顶 ( 共有1个 )

reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
高照李: 回帖置顶 2012-11-23 21:43:33
你的问题可能有2种情况

一是偶然情况，在实验中可能会碰到相同的体系分装几管做PCR，仅仅因为放的位置不同结果也不同。
二是你的PCR体系的缓冲液或者镁离子的配比浓度有问题，造成是否加水的不同结果。

所以碰到这样的情况深究起来很复杂。建议还是重新优化反应体系和PCR条件。

在多个温度梯度都没有条带且重复出现没有条带的情况下，需要调整引物特异性、退火时间、模版浓度和酶浓度。
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2楼2012-11-22 20:15:36
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
之前扩出来的PCR产物还在吗？如果在，1 送去测序看看是不是你想要的。2，把产物稀释几十倍做模版，二次PCR一次，看看有没有结果。
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高照李
4楼2012-11-22 23:18:32
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
呵呵，那你直接按照之前没加水的体系再试一次呗，顺便把扩出来的条带测个序~
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6楼2012-11-23 08:33:06
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
高照李: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-11-23 21:42:25
引用回帖:
10楼: Originally posted by 高照李 at 2012-11-23 12:01:04
今天刚刚作出一个梯度PCR，是另外一种同科不同亚科的虫子，模板浓度大约400-600ng，体系引物10mM1.5微升，退火温度梯度40-50℃（图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49. ...

43.9（第四道）就挺好的；你确定顺序没搞错就好。一般都是过高或过低都不好。还有就是习惯上，上样孔在上面。
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11楼2012-11-23 12:06:14
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普通回帖

高照李

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by reallpf at 2012-11-22 20:15:36
你的问题可能有2种情况

一是偶然情况，在实验中可能会碰到相同的体系分装几管做PCR，仅仅因为放的位置不同结果也不同。
二是你的PCR体系的缓冲液或者镁离子的配比浓度有问题，造成是否加水的不同结果。

所以 ...

多谢学长回复，我这两天有重做了，温度梯度还是没做出来，模板浓度梯度、酶浓度梯度也做了还是没出。引物空白对照也做了，引物没问题。我做的是几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段，目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增COI片段，50μl的扩增反应体系是：
Premix Ex Taq   25μl
引物1（LCO1490)（20μM）1μl
引物2 (HCO2198)（20μM）1μl
模板1μl（<50ng）1μl
灭菌蒸馏水        22μl
    PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性60s，50℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，循环结束后，72℃延伸10min。

麻烦您能否帮我看一下，有可能是哪出的问题？
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3楼2012-11-22 23:09:23
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉是镁离子的原因，不加水的体系镁离子浓度高了将近1倍。建议少用mix,自己配反应体系。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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高照李
5楼2012-11-22 23:36:56
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高照李

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 德国工兵铲 at 2012-11-22 23:18:32
之前扩出来的PCR产物还在吗？如果在，1 送去测序看看是不是你想要的。2，把产物稀释几十倍做模版，二次PCR一次，看看有没有结果。

在的，多谢提醒。
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7楼2012-11-23 11:46:00
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qiuqu_200212

至尊木虫 (知名作家)

无助又无奈

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
估计是你的反应条件没有摸索好，做梯度PCR摸索好退火温度至关重要。
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无奈又无助的天鹅，孤零零
8楼2012-11-23 11:50:20
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高照李

木虫 (正式写手)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-22 23:36:56
感觉是镁离子的原因，不加水的体系镁离子浓度高了将近1倍。建议少用mix,自己配反应体系。

谢谢提醒。
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9楼2012-11-23 11:50:29
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高照李

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-11-22 23:36:56
感觉是镁离子的原因，不加水的体系镁离子浓度高了将近1倍。建议少用mix,自己配反应体系。

今天刚刚作出一个梯度PCR，是另外一种同科不同亚科的虫子，模板浓度大约400-600ng，体系引物10mM1.5微升，退火温度梯度40-50℃（图片中从左到右40℃、40.9℃、42.3℃、43.9℃、DNAmarker1000、46.3℃、48.1℃、49.2℃、50℃），体系其他都一样。请问在进行扩增时用那个温度好些？

PM4阔胸禾梯度40-50度.JPG
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10楼2012-11-23 12:01:04
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