应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR就扩出过一次带，以后再也扩不出来，为什么，求指导
71/1返回列表
查看: 2586  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

赵建雪

银虫 (正式写手)

[求助] PCR就扩出过一次带，以后再也扩不出来，为什么，求指导

PCR就扩出过一次带，以后再也扩不出来，为什么，跪求指导，已经扩了一个多月了，重新提RNA也没有结果。
下面的图是第一次扩出的，800左右，并且悲催的是测序连接不上，直接PCR产物测序都没有测出来，
PCR就扩出过一次带，以后再也扩不出来，为什么，求指导
五种樱桃M2.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-6-18 at 07:57 ]
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖 核酸生物学实验经验

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
自己的路只有自己能负责
1楼 2013-06-17 10:44:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
赵建雪(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:56:28
1949stone: MolEPI+1 2013-06-18 07:57:44
赵建雪: 金币+7 2013-07-17 21:47:08
PCR不出现扩增条带的原因和对策：  
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。  
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。  
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。  引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。  
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 一般从1.0mmol/L逐渐分体度增加，不超过10.0mmol/L   
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。   
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。   
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
可以在反应体系中加入0.01%的白明胶或Triton X-100,有助于加大反应的特异性。
可以用热启动PCR。

如果经费不是问题，买点比较好的装配完整的PCR试剂盒吧，不要什么都从头做起。
赞一下 回复此楼
2楼2013-06-17 11:17:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

以前成功过一次，引物应该问题不大。以上都不行，又买不了好的PCR试剂盒，那么就只能重新做设计引物了。
赞一下 回复此楼
3楼2013-06-17 11:19:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
赵建雪(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-17 13:56:36
一个月了都没扩出来，并且之前的测序也测不出来说明你要扩增的序列中有非常严重的二级结构，这种高难度的片段只能交给公司去做了，自己做的话是非常困难的。
赞一下 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2013-06-17 11:22:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

赵建雪

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2013-06-17 11:22:51
一个月了都没扩出来，并且之前的测序也测不出来说明你要扩增的序列中有非常严重的二级结构，这种高难度的片段只能交给公司去做了，自己做的话是非常困难的。

但为什么先前能扩出来呀
赞一下 回复此楼
自己的路只有自己能负责
5楼2013-06-17 19:52:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sun_in_night

木虫 (小有名气)
建议重新设计引物，很可能你的引物效率不高。之前扩出来可能是运气，刚刚那时条件比较好，也可能只是你的非特异性条带
赞一下 回复此楼
6楼2013-06-18 00:02:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

real-time

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人觉得你第一次扩出来的未必是你的目的片段，原因就是因为连接不上。很多非特异扩增是乱七八糟的产物，其扩增的产物未必是一致的序列，而是很多不同的序列，末端不是正常的平末端加个A的末端，所以无法连接

简单的验证一下就是通过拿以前扩出来的产物稀释一下重新扩增一次，如果片度扩得出来，而且与上次的大小一致那么应该是正常的扩增，否则还是从新换原料，包括引物、酶等试试，不要在一棵树上吊死
赞一下 回复此楼
一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
7楼2013-06-18 08:50:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 赵建雪 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭