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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增不出目的条带
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深蓝色竹子

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增不出目的条带

我是用cDNA为模板（已经确定没问题），进行扩增1500bp的基因，都换了两次引物了，每次都会在500bp左右扩增出很亮的条带，阴性对照也有这条带，但是目的条带几乎木有，都一个月了，就是扩增不出来，请各位给予指导

dell 2013-01-15 18hr 38min.jpg
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1楼 2013-01-24 19:44:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

qiyaocheng

木虫 (小有名气)

老虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
所有试剂换新的，把水好好灭菌
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毕业回望科研路，满目疮痍一身土
8楼2013-01-26 22:28:48
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普通回帖

深蓝色竹子

新虫 (小有名气)
我用的是5000Maker，大小一次为5000,3000,2000,1000,750,500，250，100，我用的是高保真的酶，Mix也用过同样的情况！
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2楼2013-01-24 19:46:23
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换用GC rich buffer试一试，可能是产物GC含量高
另外，你有不止一对引物，可以尝试巢氏PCR
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3楼2013-01-24 20:12:23
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深蓝色竹子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-01-24 20:12:23
换用GC rich buffer试一试，可能是产物GC含量高
另外，你有不止一对引物，可以尝试巢氏PCR

我是扩增的全长，要做表达的，但是我的目的记忆总的GC含量才43%，应该不算太高吧
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4楼2013-01-24 21:43:36
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

总的GC含量不高，但是不排除某一个区域GC含量高，PCR到这个区域后可能延伸不下去
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5楼2013-01-25 09:03:27
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，如何确定cDNA没有问题？
最大的可能就是引物没设计好，请再提高退火温度试试或者减少引物的量，你的所有样品扩增都是smear，如果还不行，请重新设计引物。
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6楼2013-01-25 10:39:19
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platanus

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我个人觉得是你的引物的问题，引物设计得不是很好，可以提高退火温度去跑试试看，实在不行重新设计引物吧！
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7楼2013-01-25 11:48:01
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木--林--森

铜虫 (小有名气)
我今天的PCR扩增也失败了，找不出原因！
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没有什么了不起的！
9楼2013-01-28 00:26:27
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dkyy970111

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

实在不行换一步法RT-PCR试剂盒。
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打铁还要自身硬
10楼2013-01-28 16:01:32
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