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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr p不出特异性条带
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pcr p不出特异性条带 已有12人参与

我最近做的pcr  目的片段是1194，做了三次pcr 分别用59   61   63度的退火温度，在62度是能p出来条带，但是非特异性条带很多，提高到63度是出现一条大约在800bp的条带   ，不知道是怎么回事
            模板  1
            引物   1
                       1
             酶   0.5
            水   23
           buffer  3
          dNTP    1
这是体现，请教大家了
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1楼 2010-08-25 11:38:11
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zhang.hai.f

木虫 (小有名气)
我也是新手，不好意思
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2楼2010-08-25 11:49:29
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张焕春

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
是不是引物不好
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3楼2010-08-25 12:14:24
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怎么都行

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+3):很全面，很活跃~ 2010-08-25 12:37:42
对于你说的情况，62度能扩增而63度只扩出一条非目的带，我猜你可以用touch down PCR试试，退火温度由65度降落到60度， 每循环降落0.5度，10个循环，后20个循环用60度退火。
还有，你的引物设计出来后有没有BLAST比对过，说不定该对引物能跟该物种基因组的其他位置更易结合引发。
还有一个可能，你设计的这段引物在该物种基因组的变异热点区域，存在序列deletion等变异方式，你用作引物设计的模板序列在该区域长度是1194，但你做的那个生物株系或许就只有800bp左右也说不定。
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4楼2010-08-25 12:31:26
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crydevil

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果体系没有问题的话，做个梯度退火试试在哪个温度能出来目的片段，前提是你一定要清楚目的片段大小
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5楼2010-08-25 13:53:50
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

补充

我在退火温度是61时曾经p出特异条带，但是其中有很多非特异条带
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6楼2010-08-25 19:39:13
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陈思容

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
反应体系有问题，你能把每个反应组分的浓度标出来吗
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7楼2010-08-25 19:44:22
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vivihao

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
就62度扩增，多加几个循环条带就量了。
再摸一下反应体系。
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8楼2010-08-25 20:33:22
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huanshi

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
你既然可以p出非特异，体系就先不讨论了。

想问下，既然62可以 P出来，那你59没有P出来吗？

另外把你引物的序列和所要扩增的基因名称发上来，让大家分析看看。
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9楼2010-08-25 21:11:19
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薄荷zwz

新虫 (小有名气)
silicare:新手上路，有些错误是难免的，也算收获了一个经验值 2010-08-28 09:21:34
刚刚发现下游引物设计反了
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10楼2010-08-27 16:14:06
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