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薄荷zwz

新虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】pcr p不出特异性条带已有12人参与

我最近做的pcr  目的片段是1194，做了三次pcr 分别用59 61 63度的退火温度，在62度是能p出来条带，但是非特异性条带很多，提高到63度是出现一条大约在800bp的条带，不知道是怎么回事
         模板  1
         引物 1
                     1
         酶 0.5
         水 23
         buffer  3
      dNTP 1
这是体现，请教大家了

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1楼2010-08-25 11:38:11

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zhang.hai.f

木虫 (小有名气)

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我也是新手，不好意思

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2楼2010-08-25 11:49:29

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张焕春

新虫 (初入文坛)

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是不是引物不好

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3楼2010-08-25 12:14:24

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怎么都行

银虫 (小有名气)

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lstt09nk(金币+3):很全面，很活跃~ 2010-08-25 12:37:42

对于你说的情况，62度能扩增而63度只扩出一条非目的带，我猜你可以用touch down PCR试试，退火温度由65度降落到60度，每循环降落0.5度，10个循环，后20个循环用60度退火。
还有，你的引物设计出来后有没有BLAST比对过，说不定该对引物能跟该物种基因组的其他位置更易结合引发。
还有一个可能，你设计的这段引物在该物种基因组的变异热点区域，存在序列deletion等变异方式，你用作引物设计的模板序列在该区域长度是1194，但你做的那个生物株系或许就只有800bp左右也说不定。

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4楼2010-08-25 12:31:26

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