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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 想问下在以cDNA为模板时，PCR的结果却是徒步 什么原因
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Lee_Py

银虫 (小有名气)

[求助] 想问下在以cDNA为模板时，PCR的结果却是徒步 什么原因

用内标P的结果就很好 说明不是CDNA的问题  但是为啥用自己的引物却P那么差 P的根marker一样
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1楼2011-06-02 12:56:32
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-02 20:42:25
我最近做拼接PCR也是弥散带，把所有的东西都换了一遍，锁定引物和模版。我的模板质粒非常异常，超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一个也是用了好久的。
说了半天，你的情况我觉得是cDNA浓度太高，或者你加的量过多了，不妨说详细点，大家研究研究
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2楼2011-06-02 15:29:51
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Lee_Py

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-06-02 15:29:51:
我最近做拼接PCR也是弥散带，把所有的东西都换了一遍，锁定引物和模版。我的模板质粒非常异常，超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一个也是用了好久的。
说了半天，你的情况我觉得是cDNA浓度太高，或者你加的量过多 ...

嘿嘿 首先感谢下  但是我做了几个梯度  反转的cDNA我分别稀释了10倍、50倍、80倍、100倍 但是条带还是很弥散 那几个梯度P的结果都基本一样 稀释的模板我也都是加1ul 50的体系
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3楼2011-06-02 17:07:38
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Lee_Py

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-06-02 15:29:51:
我最近做拼接PCR也是弥散带，把所有的东西都换了一遍，锁定引物和模版。我的模板质粒非常异常，超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一个也是用了好久的。
说了半天，你的情况我觉得是cDNA浓度太高，或者你加的量过多 ...

嘿嘿 首先感谢下  但是我做了几个梯度  反转的cDNA我分别稀释了10倍、50倍、80倍、100倍 但是条带还是很弥散 那几个梯度P的结果都基本一样 稀释的模板我也都是加1ul 50的体系
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4楼2011-06-02 17:16:11
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-06-02 20:42:33
Lee_Py(金币+2): 2011-06-04 15:49:38
引用回帖:
Originally posted by Lee_Py at 2011-06-02 17:07:38:
嘿嘿 首先感谢下  但是我做了几个梯度  反转的cDNA我分别稀释了10倍、50倍、80倍、100倍 但是条带还是很弥散 那几个梯度P的结果都基本一样 稀释的模板我也都是加1ul 50的体系

引物特异性不好吧。
我以前P侧翼序列时。经常P出弥散带，就是真实PCR的反映。结果优化后能P出单一条带也是单引物自扩结果。

如果你一定要优化条件，可以用TOUCH DOWN。 就是退火逐步降低。我的经验是能筛到单一条带。但不保证是你要的目的条带。
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5楼2011-06-02 17:17:02
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-06-02 20:42:43
Lee_Py(金币+3): 2011-06-04 15:49:46
LZ 的目的条带多长啊？其实内标很好并不能说明cDNA好啊，我这段时间做的用国产试剂盒反转录就能出actin但是目的条带不出（目的条带2100bp）,后来换个进口反转录试剂盒，一次目的条带就出了，当然actin也出。 不知道LZ最后P出来目的条带没啊？
另外引物特异性问题，LZ可以用NCBI上blast一下，看看非特异性扩增多不多，如果不行就试一下改改引物。
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6楼2011-06-02 18:40:16
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