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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr一直不出结果，可以从哪些方面调整
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恶魔眼球

木虫 (小有名气)

[求助] pcr一直不出结果，可以从哪些方面调整

最近做pcr一直不出结果，只出现了引物二聚体，试过减少引物的量，减少酶量。。。还可以从哪些方面调整。PS:我们的反应体系是20uL的：ddwater 13.7uL,buffer 2.0uL,引物各1.0uL(10uM),dNTP0.8uL,Taq 酶0.5uL(2U/uL),模板1uL;反应过程：95° 5min,(94°  40s，58°  50s, 72°  50s)35cycles,72°  10min;目的条带是1200bp的，我们的引物Tm值一个是51.65，一个是56.06；退火温度试过55,56,58;曾在58°按照上述体系出来过结果一次，后来再没出来过。各位大虾，请指点迷津~~

marker 是DL2000

[ Last edited by 恶魔眼球 on 2011-12-17 at 15:22 ]
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1楼 2011-12-17 15:12:19
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回帖置顶 ( 共有1个 )

wanghd2826

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 我觉得这个讲得很有道理！破格授予专家指数一枚！ 2011-12-19 16:47:25
恶魔眼球(金币+1): ★★★很有帮助 2011-12-25 10:40:17
之前我也遇到过楼主一样的问题，照片简直一模一样的（不过maker跑的比你的好。。呵呵），下面是个人的一点经验：
1、首先既然在58度时曾经扩出来过，那至少说明模板和引物没啥大问题（除非之后你又换过模板）
2、模板引物没啥大问题就是优化PCR条件了，方法很多，梯度，降落，巢氏PCR等都可以，但是要找到适合你基因的方法（最好查文献），先从tm入手，可以用你两条引物中tm值较低的那条，再减去个4度试下，当然也可以做个梯度，如果效果还是这样的话（只有二聚体），我就深度怀疑是模板的问题了，因为之前我做也是试了很多条件，酶也换过，mix和分开的Taq都用过，体系也换过，就是出不来，后来重新提了rna反转录之后，一下就出来了，我感觉优化条件是在有条带的情况之下才考虑的，连带都没有纠结优化条件就有点不合适了。
3、另外，建议你用引物设计软件，最好是Oligo 来检测下你的两条引物，Oligo比较全面，看下引物有没有loop之类的二级结构，如果有的话，就得适当提高退火温度。
4、不知道你的引物是简并引物呢还是特异引物，特异引物会简单点，如果是简并引物，而且简并度高的话（大于1000），那就干脆把退火温度设在45-50就ok，适当缩短延伸时间。
个人的一点经验，希望对你有用，祝顺利！
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14楼2011-12-19 15:37:31
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-12-17 19:53:23
你的引物与模板配对区的Tm值是多少？（将你添加的酶切位点等非配对区先去掉）。而且，即使如你所说，你的退火温度应该调低到50度再试试。一般建议退火温度比Tm值低一些，当特异性不好时，才逐步提高退火温度
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2楼2011-12-17 15:48:28
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以使用降落PCR，从62度每个循环降1度，降到50度，再50度20个循环。
（还不行的话就反过来，上升，从45度升到58度，会跑出来很多带，挑你要的切胶回收，克隆。祝你成功）
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生命不息，探索不止。
3楼2011-12-17 20:17:58
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先摸索温度梯度。。。
一般经典的PCR体系基本都可以扩增出来的。。。
延伸时间2min即可。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-12-18 20:03:58
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的引物会不会设计的有问题？
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
5楼2011-12-19 02:59:02
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yidC423R

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
梯度pcr, 试加 2%dmso

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2011-12-19 07:52:37
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xiaohaiyu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
延伸设成7分钟吧，你的体系里不是什么加的体积是多少，而是应该考虑各个物质在体系中的实际含量是多少。祝你顺利。
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7楼2011-12-19 08:23:48
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guotaorice

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议延长延伸时间，一般1Min扩增1K，设个90S或120S试试。
祝你成功！
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8楼2011-12-19 09:05:19
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蚊在江湖

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
温度梯度做开一点

可以在体系中加一点DMSO

换引物
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9楼2011-12-19 11:43:56
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阿德54007

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+3): 鼓励分享经验！ 2011-12-19 16:45:21
在设计引物的时候咬考虑上下游引物的Tm相等或接近，你这两对引物的差异有点大。可以考虑51~55，设置降落PCR试一下。还有就是稀释一下模板的浓度，我们实验室有一次怎么也扩增不出来条带，将模板稀释10倍就扩增出了。或者用保真度不同的酶或者Mix试试。另外你的延伸时间有点短，一般延伸速度是1000bp/min。
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阳光温热，岁月静好，你还没来，我怎敢老
10楼2011-12-19 12:19:16
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