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恶魔眼球

木虫 (小有名气)

应助: 2 (幼儿园)
金币: 4527.6
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红花: 2
帖子: 195
在线: 376.6小时
虫号: 1253660
注册: 2011-04-02
性别: MM
专业: 动物遗传学

[求助] pcr一直不出结果，可以从哪些方面调整

最近做pcr一直不出结果，只出现了引物二聚体，试过减少引物的量，减少酶量。。。还可以从哪些方面调整。PS:我们的反应体系是20uL的：ddwater 13.7uL,buffer 2.0uL,引物各1.0uL(10uM),dNTP0.8uL,Taq 酶0.5uL(2U/uL),模板1uL;反应过程：95° 5min,(94° 40s，58° 50s, 72° 50s)35cycles,72° 10min;目的条带是1200bp的，我们的引物Tm值一个是51.65，一个是56.06；退火温度试过55,56,58;曾在58°按照上述体系出来过结果一次，后来再没出来过。各位大虾，请指点迷津~~

marker 是DL2000

[ Last edited by 恶魔眼球 on 2011-12-17 at 15:22 ]

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1楼 2011-12-17 15:12:19

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wanghd2826

铁虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 16 (小学生)
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虫号: 1316229
注册: 2011-06-06
性别: GG
专业: 森林生物学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 我觉得这个讲得很有道理！破格授予专家指数一枚！ 2011-12-19 16:47:25
恶魔眼球(金币+1): ★★★很有帮助 2011-12-25 10:40:17

之前我也遇到过楼主一样的问题，照片简直一模一样的（不过maker跑的比你的好。。呵呵），下面是个人的一点经验：
1、首先既然在58度时曾经扩出来过，那至少说明模板和引物没啥大问题（除非之后你又换过模板）
2、模板引物没啥大问题就是优化PCR条件了，方法很多，梯度，降落，巢氏PCR等都可以，但是要找到适合你基因的方法（最好查文献），先从tm入手，可以用你两条引物中tm值较低的那条，再减去个4度试下，当然也可以做个梯度，如果效果还是这样的话（只有二聚体），我就深度怀疑是模板的问题了，因为之前我做也是试了很多条件，酶也换过，mix和分开的Taq都用过，体系也换过，就是出不来，后来重新提了rna反转录之后，一下就出来了，我感觉优化条件是在有条带的情况之下才考虑的，连带都没有纠结优化条件就有点不合适了。
3、另外，建议你用引物设计软件，最好是Oligo 来检测下你的两条引物，Oligo比较全面，看下引物有没有loop之类的二级结构，如果有的话，就得适当提高退火温度。
4、不知道你的引物是简并引物呢还是特异引物，特异引物会简单点，如果是简并引物，而且简并度高的话（大于1000），那就干脆把退火温度设在45-50就ok，适当缩短延伸时间。
个人的一点经验，希望对你有用，祝顺利！