24小时热门版块排行榜    

查看: 2776  |  回复: 13
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看

vickievickie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
试一下梯度温度退火呗~温度太高了吧
祝我的实验一发不可收拾
11楼2011-12-19 14:26:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+1): 鼓励应助! 2011-12-19 16:45:45
看了半天,不知道你的模板是质粒?还是基因组?还是RT 产物?不同模板对引物的要求也不同,如果是质粒,随便的引物都能扩出来,如果是后两种,一定要设计特异性比较高的引物来扩增。
12楼2011-12-19 14:43:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

还有,你的目的片段1200,你用50S的延伸时间肯定不行,一般你这长度至少需要1MIN10S的时间,如果是PFU酶来扩增,时间要加倍,所以你自己去调节吧。
13楼2011-12-19 14:45:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wanghd2826

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 我觉得这个讲得很有道理!破格授予专家指数一枚! 2011-12-19 16:47:25
恶魔眼球(金币+1): ★★★很有帮助 2011-12-25 10:40:17
之前我也遇到过楼主一样的问题,照片简直一模一样的(不过maker跑的比你的好。。呵呵),下面是个人的一点经验:
1、首先既然在58度时曾经扩出来过,那至少说明模板和引物没啥大问题(除非之后你又换过模板)
2、模板引物没啥大问题就是优化PCR条件了,方法很多,梯度,降落,巢氏PCR等都可以,但是要找到适合你基因的方法(最好查文献),先从tm入手,可以用你两条引物中tm值较低的那条,再减去个4度试下,当然也可以做个梯度,如果效果还是这样的话(只有二聚体),我就深度怀疑是模板的问题了,因为之前我做也是试了很多条件,酶也换过,mix和分开的Taq都用过,体系也换过,就是出不来,后来重新提了rna反转录之后,一下就出来了,我感觉优化条件是在有条带的情况之下才考虑的,连带都没有纠结优化条件就有点不合适了。
3、另外,建议你用引物设计软件,最好是Oligo 来检测下你的两条引物,Oligo比较全面,看下引物有没有loop之类的二级结构,如果有的话,就得适当提高退火温度。
4、不知道你的引物是简并引物呢还是特异引物,特异引物会简单点,如果是简并引物,而且简并度高的话(大于1000),那就干脆把退火温度设在45-50就ok,适当缩短延伸时间。
个人的一点经验,希望对你有用,祝顺利!
14楼2011-12-19 15:37:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 恶魔眼球 的主题更新
信息提示
请填处理意见