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汕头大学海洋科学接受调剂
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Lee_Py

银虫 (小有名气)

[求助] 想问下在以cDNA为模板时,PCR的结果却是徒步 什么原因

用内标P的结果就很好 说明不是CDNA的问题  但是为啥用自己的引物却P那么差 P的根marker一样
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yabxxh

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-02 20:42:25
我最近做拼接PCR也是弥散带,把所有的东西都换了一遍,锁定引物和模版。我的模板质粒非常异常,超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一个也是用了好久的。
说了半天,你的情况我觉得是cDNA浓度太高,或者你加的量过多了,不妨说详细点,大家研究研究
2楼2011-06-02 15:29:51
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Lee_Py

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-06-02 15:29:51:
我最近做拼接PCR也是弥散带,把所有的东西都换了一遍,锁定引物和模版。我的模板质粒非常异常,超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一个也是用了好久的。
说了半天,你的情况我觉得是cDNA浓度太高,或者你加的量过多 ...

嘿嘿 首先感谢下  但是我做了几个梯度  反转的cDNA我分别稀释了10倍、50倍、80倍、100倍 但是条带还是很弥散 那几个梯度P的结果都基本一样 稀释的模板我也都是加1ul 50的体系
3楼2011-06-02 17:07:38
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Lee_Py

银虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yabxxh at 2011-06-02 15:29:51:
我最近做拼接PCR也是弥散带,把所有的东西都换了一遍,锁定引物和模版。我的模板质粒非常异常,超螺旋的部分亮度太亮了。引物有一个也是用了好久的。
说了半天,你的情况我觉得是cDNA浓度太高,或者你加的量过多 ...

嘿嘿 首先感谢下  但是我做了几个梯度  反转的cDNA我分别稀释了10倍、50倍、80倍、100倍 但是条带还是很弥散 那几个梯度P的结果都基本一样 稀释的模板我也都是加1ul 50的体系
4楼2011-06-02 17:16:11
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-06-02 20:42:33
Lee_Py(金币+2): 2011-06-04 15:49:38
引用回帖:
Originally posted by Lee_Py at 2011-06-02 17:07:38:
嘿嘿 首先感谢下  但是我做了几个梯度  反转的cDNA我分别稀释了10倍、50倍、80倍、100倍 但是条带还是很弥散 那几个梯度P的结果都基本一样 稀释的模板我也都是加1ul 50的体系

引物特异性不好吧。
我以前P侧翼序列时。经常P出弥散带,就是真实PCR的反映。结果优化后能P出单一条带也是单引物自扩结果。

如果你一定要优化条件,可以用TOUCH DOWN。 就是退火逐步降低。我的经验是能筛到单一条带。但不保证是你要的目的条带。
5楼2011-06-02 17:17:02
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-06-02 20:42:43
Lee_Py(金币+3): 2011-06-04 15:49:46
LZ 的目的条带多长啊?其实内标很好并不能说明cDNA好啊,我这段时间做的用国产试剂盒反转录就能出actin但是目的条带不出(目的条带2100bp),后来换个进口反转录试剂盒,一次目的条带就出了,当然actin也出。 不知道LZ最后P出来目的条带没啊?
另外引物特异性问题,LZ可以用NCBI上blast一下,看看非特异性扩增多不多,如果不行就试一下改改引物。
6楼2011-06-02 18:40:16
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