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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于荧光定量PCR中cdna合成的问题
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】关于荧光定量PCR中cdna合成的问题 已有7人参与

各位高手请指点啊 ，小弟在此谢过了
我是做荧光定量pcr的 在其上游步骤cdna合成中 我用primescript 1st strand cdna synthesis kit 时得到的cdna用内参引物β-actin进行半定量pcr鉴定结果发现目的条带比较淡，但无其他杂带。但是我用他们公司推荐的专门用于荧光定量pcr的可以去除基因组dna污染的试剂盒primescript RT reagent kit with gDNA eraser时可以得到目的条带比较亮，但是却有小于100bp的引物二聚体，呈弥散雾状分布在下方，听师姐说cdna合成后是需要基因组dna的去除的，请问各位高手这是怎么回事
谢谢
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三人行必有我师
1楼 2010-10-30 15:17:32
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

请高手回复啊 ，不然我这帖子就石沉大海了啊

请高手指点啊 不然我这帖子就石沉大海了啊
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三人行必有我师
2楼2010-11-02 08:59:13
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
听师姐说cdna合成后是需要基因组dna的去除的
那是必须的
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3楼2010-11-02 09:36:04
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有基因组存在，定量就不准了
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4楼2010-11-02 12:36:49
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

谢谢你的回复 我再试试吧

引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-11-02 12:36:49:
有基因组存在，定量就不准了

谢谢你的回复 我再尝试下啊
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三人行必有我师
5楼2010-11-03 09:59:02
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tsq0126

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-04 11:06:12
那可以在反转录之前用DNA酶消化一下，或者现在TAKARA公司也有专门的反转录试剂盒，本身就含有DNA酶，反转录的同时也把基因组DNA消化啦，很简单的，一起才以前一千钱左右。
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6楼2010-11-04 09:38:06
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-04 11:57:21
1、严格的提取RNA是最关键的一步，如果有条件就上Qiagen的盒子或者用Trizol等自己按照方法提取。

2、良好的总RNA，如果需要，可以纯化，获取mRNA，纯化的柱子好坏有差异，一般一分钱一分货。

3、可参考一下 fermentas的revert Aid系列的反转录酶，选择适合你的种类。

4、反转录后的效率测定，一定注意严格定量哦！引物的合成，请采用色谱级别。稀释时注意均匀。

5、实时定量的反应条件确定吗？管子等都得考虑上乘的质量哈。
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-11-04 11:19:06
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

我有这试剂盒 但有问题

引用回帖:
Originally posted by tsq0126 at 2010-11-04 09:38:06:
那可以在反转录之前用DNA酶消化一下，或者现在TAKARA公司也有专门的反转录试剂盒，本身就含有DNA酶，反转录的同时也把基因组DNA消化啦，很简单的，一起才以前一千钱左右。

我有这种可以去除基因组DNA的primerscript RT reagent kit with gDNA eraser(perfect real time)的专门为荧光定量的试剂盒，可是得到的CDNA进行以内参基因β-actin为引物pcr扩增时出现非特异性扩增。以前用那种不含基因组DNA去除的普通试剂盒primerscript 1st strand cdna synthesis kit 时反而没有非特异性扩增，这是怎么回事呢？ 我是想用去除基因组DNA的primerscript RT reagent kit with gDNA eraser(perfect real time)的专门为荧光定量的试剂盒，怎样才能避免非特异性扩增呢？
非特异性扩增一般在目的条带下面呈雾状团簇状分布，有点像云朵，也有小于100bp的引物二聚体。
请各位高手指点一二，小弟不胜感激!
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三人行必有我师
8楼2010-11-05 09:51:02
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

谢谢你的回复

引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-11-04 11:19:06:
1、严格的提取RNA是最关键的一步，如果有条件就上Qiagen的盒子或者用Trizol等自己按照方法提取。

2、良好的总RNA，如果需要，可以纯化，获取mRNA，纯化的柱子好坏有差异，一般一分钱一分货。

3、可参考一下 ...

谢谢这位高人的指点，谢谢
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三人行必有我师
9楼2010-11-05 09:52:21
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

谢谢你的回复

引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-11-02 12:36:49:
有基因组存在，定量就不准了

谢谢你的回复啊！
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三人行必有我师
10楼2010-11-05 09:53:35
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