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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)

[求助] 反转录

反转录不是很容易成功么，可是为什么我最近做的反转录效果都很差呢，RNA跑的带很亮，浓度大概0.5~1ug/ul，这个浓度做反转录应该够了呀，而且RNA提完后马上就反转录了，条件是65度5分钟、42度1小时、85度5分钟，可是为什么就是没有cDNA呢，此问题急需得到解决，必当重谢！！！
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【分子生物】EPI帖

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既然选择了远方就要风雨兼程
1楼 2011-09-30 22:39:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-02 14:14:07
所谓的没有cDNA是怎么看的呢？别告诉我是直接跑胶看
用cDNA作模板，内参基因能PCR扩增出来吗？这个是检验cDNA质量的常规方法。
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2楼2011-09-30 23:45:23
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447585565

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-02 14:14:19
CDNA跑胶好浪费哦，没条带的话用测浓度的机子测一下吧。最好是扩下内参试试看。如果出不来的话，可以考虑下是不是做RT的时候试剂加漏了或者试剂有问题，如果是这样建议在左下反转录试试。
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3楼2011-10-01 12:33:30
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tcd530

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

确定一下你的目的基因是否表达，目的RNA的丰度太低也是很难反转录出来的
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4楼2011-10-01 21:04:58
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这个可以吗

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-02 14:14:27
看了123等楼的观点，有几点想说：1楼说的正确，还是要扩增下才知道的，扩增后内参有条带目的基因没有可能说明目的基因没表达，内参没条带才有可能说明反转录不成功：2楼说的浪费不怎合适，因为不扩增电泳根本没啥意义。3楼说的基本不正确，反转录引物固定，不分辨是何种RNA，如真核生物常用的OligdT，是把所有RNA都反转录了的。望楼主仔细分析实验过程。
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西瓜
5楼2011-10-01 22:07:59
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1楼: Originally posted by 西风的安逸 at 2011-09-30 22:39:32:
反转录不是很容易成功么，可是为什么我最近做的反转录效果都很差呢，RNA跑的带很亮，浓度大概0.5~1ug/ul，这个浓度做反转录应该够了呀，而且RNA提完后马上就反转录了，条件是65度5分钟、42度1小时、85度5分钟，可 ...

反转录后不是一般都用电泳检测效果么，你为什么对这种做法如此不赞同呢，呵呵。。。。
而且我用cDNA做了PCR扩增，什么条带都没有，所以我推测是不是没有cDNA，是否转录出现了问题
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既然选择了远方就要风雨兼程
6楼2011-10-02 09:54:00
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-10-02 14:14:48
我个人觉得还是扩一下内参，还有就是我个人的经历：就是taq酶失效。
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风雪夜归人
7楼2011-10-02 11:15:01
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

西风的安逸(金币+5): 非常感谢 2011-10-02 21:33:27
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西风的安逸 at 2011-10-02 09:54:00:
反转录后不是一般都用电泳检测效果么，你为什么对这种做法如此不赞同呢，呵呵。。。。
而且我用cDNA做了PCR扩增，什么条带都没有，所以我推测是不是没有cDNA，是否转录出现了问题

反转录后一般不用电泳检测：首先cDNA比较珍贵（反转录酶贵），浪费；其次，cDNA是总的cDNA，含量也低，条带是模糊的淡淡的一片，根本提供不了任何信息。
一般是用actin、tublin等内参基因进行扩增来检验cDNA质量。
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8楼2011-10-02 15:11:33
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-10-02 11:15:01:
我个人觉得还是扩一下内参，还有就是我个人的经历：就是taq酶失效。

恩，谢谢
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既然选择了远方就要风雨兼程
9楼2011-10-02 21:52:59
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poog502

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-10-02 15:11:33:
反转录后一般不用电泳检测：首先cDNA比较珍贵（反转录酶贵），浪费；其次，cDNA是总的cDNA，含量也低，条带是模糊的淡淡的一片，根本提供不了任何信息。
一般是用actin、tublin等内参基因进行扩增来检验cDNA质量。

确实如此！
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10楼2011-10-03 11:43:46
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