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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)

[求助] 反转录

反转录不是很容易成功么,可是为什么我最近做的反转录效果都很差呢,RNA跑的带很亮,浓度大概0.5~1ug/ul,这个浓度做反转录应该够了呀,而且RNA提完后马上就反转录了,条件是65度5分钟、42度1小时、85度5分钟,可是为什么就是没有cDNA呢,此问题急需得到解决,必当重谢!!!
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既然选择了远方就要风雨兼程
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助! 2011-10-02 14:14:07
所谓的没有cDNA是怎么看的呢?别告诉我是直接跑胶看
用cDNA作模板,内参基因能PCR扩增出来吗?这个是检验cDNA质量的常规方法。
2楼2011-09-30 23:45:23
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447585565

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助! 2011-10-02 14:14:19
CDNA跑胶好浪费哦,没条带的话用测浓度的机子测一下吧。最好是扩下内参试试看。如果出不来的话,可以考虑下是不是做RT的时候试剂加漏了或者试剂有问题,如果是这样建议在左下反转录试试。
3楼2011-10-01 12:33:30
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tcd530

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

确定一下你的目的基因是否表达,目的RNA的丰度太低也是很难反转录出来的
4楼2011-10-01 21:04:58
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这个可以吗

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助! 2011-10-02 14:14:27
看了123等楼的观点,有几点想说:1楼说的正确,还是要扩增下才知道的,扩增后内参有条带目的基因没有可能说明目的基因没表达,内参没条带才有可能说明反转录不成功:2楼说的浪费不怎合适,因为不扩增电泳根本没啥意义。3楼说的基本不正确,反转录引物固定,不分辨是何种RNA,如真核生物常用的OligdT,是把所有RNA都反转录了的。望楼主仔细分析实验过程。

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5楼2011-10-01 22:07:59
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
1楼: Originally posted by 西风的安逸 at 2011-09-30 22:39:32:
反转录不是很容易成功么,可是为什么我最近做的反转录效果都很差呢,RNA跑的带很亮,浓度大概0.5~1ug/ul,这个浓度做反转录应该够了呀,而且RNA提完后马上就反转录了,条件是65度5分钟、42度1小时、85度5分钟,可 ...

反转录后不是一般都用电泳检测效果么,你为什么对这种做法如此不赞同呢,呵呵。。。。
而且我用cDNA做了PCR扩增,什么条带都没有,所以我推测是不是没有cDNA,是否转录出现了问题
既然选择了远方就要风雨兼程
6楼2011-10-02 09:54:00
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wqj1988926

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-10-02 14:14:48
我个人觉得还是扩一下内参,还有就是我个人的经历:就是taq酶失效。
风雪夜归人
7楼2011-10-02 11:15:01
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

西风的安逸(金币+5): 非常感谢 2011-10-02 21:33:27
引用回帖:
6楼: Originally posted by 西风的安逸 at 2011-10-02 09:54:00:
反转录后不是一般都用电泳检测效果么,你为什么对这种做法如此不赞同呢,呵呵。。。。
而且我用cDNA做了PCR扩增,什么条带都没有,所以我推测是不是没有cDNA,是否转录出现了问题

反转录后一般不用电泳检测:首先cDNA比较珍贵(反转录酶贵),浪费;其次,cDNA是总的cDNA,含量也低,条带是模糊的淡淡的一片,根本提供不了任何信息。
一般是用actin、tublin等内参基因进行扩增来检验cDNA质量。
8楼2011-10-02 15:11:33
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西风的安逸

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by wqj1988926 at 2011-10-02 11:15:01:
我个人觉得还是扩一下内参,还有就是我个人的经历:就是taq酶失效。

恩,谢谢
既然选择了远方就要风雨兼程
9楼2011-10-02 21:52:59
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poog502

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-10-02 15:11:33:
反转录后一般不用电泳检测:首先cDNA比较珍贵(反转录酶贵),浪费;其次,cDNA是总的cDNA,含量也低,条带是模糊的淡淡的一片,根本提供不了任何信息。
一般是用actin、tublin等内参基因进行扩增来检验cDNA质量。

确实如此!
10楼2011-10-03 11:43:46
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