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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
送鲜花一朵
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 根据楼主反映，理应授予专家指数！Good！ 2011-10-04 09:01:53
引用回帖:
5楼: Originally posted by 这个可以吗 at 2011-10-01 22:07:59:
看了123等楼的观点，有几点想说：1楼说的正确，还是要扩增下才知道的，扩增后内参有条带目的基因没有可能说明目的基因没表达，内参没条带才有可能说明反转录不成功：2楼说的浪费不怎合适，因为不扩增电泳根本没啥 ...

跟您切磋下，呵呵：
一，您说的3楼（实际是4楼啦）有道理的，可以通过western等手段，先确定目的蛋白有一定的表达。要是蛋白没有检测到表达，那RT-PCR就很难做了，甚至没必要做。

二，关于反转录引物，我想唠叨几句。反转移用的引物有三种：
1. Oligo dT:可以跟mRNA的poly A尾巴结合，作为引物，主要适合于长链甚至全长mRNA的引物，但是用Oligo dT不能反转录其他RNA（没有poly A）。
2. 随机引物，常见的是6个碱基的random 6 mers：可以跟所有类型的RNA结合，特别适合丰度低和具有复杂二级结构的模板。
3.基因特异的引物（gene-specific primer）：常用于一步法的反转录PCR（反转录和PCR在同一管里面进行），只反转录特定的片段。跟普通PCR的引物类似，需要知道模板序列。

个人之见，欢迎大家指教，共同学习哈 祝大家假期愉快~
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11楼2011-10-04 00:21:01
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红多多

木虫 (正式写手)

版筑饭牛的日子

【答案】应助回帖

1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-04 14:12:55
RNA提取最后一步乙醇需要充分挥发后再加水溶解，残留的乙醇会影响反转录效率，DNase I 处理后要用酚氯仿抽提，注意是水饱和酚。另外你说的没有cDNA这个貌似用电泳的方法是不太合适的，成本不划算检测效果也不好，可以设计内参后等比稀释cDNA然后确定cDNA质量，当然前提是这样做对你是值得的，我一般扩扩基因，做做荧光定量都不检测cDNA质量的，这个做多了就好了，没有什么技术上的难度。在就是实验过程中防止RNA污染，个人的经验是操作台干净，不要开风机，使用进口耗材，冰上加样。
我一般反转录都是这样做的
RNA
oligo dT或oligo dT-接头
特异性引物（按实验需要确定是否加入）
5’接头引物（按实验需要确定是否加入）
随机小片段random 6等
dNTP
DEPC水配到10ul
65度预变性5min后冰上速冷
加入RT酶
RNase抑制剂配到20ul
42度1.5H
出来的cDNA一般都能符合要求
具体不明白的可以参照CLONTECH SMART RACE KIT 说明书上反转录方法
酶和抑制剂我用的promega MMLV和fermentas的
引物和接头都是上海生工合成的
其他东西都是从大连宝生物买的

反转录很简单的 祝你实验成功
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

jinglove1986
可以用QQ找我……
12楼2011-10-04 10:42:00
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Ms_Garfield

新虫 (初入文坛)
cdna 一般不好用仪器检测 最好的办法是用内参跑个普通的PCR  检测下质量 然后再括目的基因 做实时跑脚的都可以
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13楼2011-10-13 20:26:50
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-09-30 23:45:23:
所谓的没有cDNA是怎么看的呢？别告诉我是直接跑胶看
用cDNA作模板，内参基因能PCR扩增出来吗？这个是检验cDNA质量的常规方法。

我用一种真菌提取出ＲＮＡ后直接进行了反转录，其中1kb的基因能够扩增出来，但是另外一个基因2kb却扩增不出来，如果扩增出来的算是内参基因的话，是不是我的RNA提取没有问题，那为什么我的2kb的扩增不出来呢
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14楼2011-12-09 22:24:36
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jinglove1986

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
12楼: Originally posted by 红多多 at 2011-10-04 10:42:00:
RNA提取最后一步乙醇需要充分挥发后再加水溶解，残留的乙醇会影响反转录效率，DNase I 处理后要用酚氯仿抽提，注意是水饱和酚。另外你说的没有cDNA这个貌似用电泳的方法是不太合适的，成本不划算检测效果也不好， ...

您好，我在做反转录，有问题想咨询一下，
1、我在宝生物定的Olig dT,包装是16nmol(约2OD)的，说明书上说是要稀释成50pmol/ul。我加了320ul的DEPC水对吗？？急求回复，感谢不尽
2、反转录的时候我一直用42度30min,想问一下，要是延长时间至1个小时，cDNA效果会更好吗？
急求回复，感谢不尽
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15楼2011-12-18 18:15:54
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cfynocry
16楼2012-04-11 23:00:19
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czcpudai

铜虫 (正式写手)
您好，我也想问一下，反转录42度30min还是50min好呢？
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17楼2012-11-05 10:30:09
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