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反转录
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| 反转录不是很容易成功么，可是为什么我最近做的反转录效果都很差呢，RNA跑的带很亮，浓度大概0.5~1ug/ul，这个浓度做反转录应该够了呀，而且RNA提完后马上就反转录了，条件是65度5分钟、42度1小时、85度5分钟，可是为什么就是没有cDNA呢，此问题急需得到解决，必当重谢！！！ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
1949stone(MolEPI+1): 鼓励 2011-10-04 14:12:55
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RNA提取最后一步乙醇需要充分挥发后再加水溶解，残留的乙醇会影响反转录效率，DNase I 处理后要用酚氯仿抽提，注意是水饱和酚。另外你说的没有cDNA这个貌似用电泳的方法是不太合适的，成本不划算检测效果也不好，可以设计内参后等比稀释cDNA然后确定cDNA质量，当然前提是这样做对你是值得的，我一般扩扩基因，做做荧光定量都不检测cDNA质量的，这个做多了就好了，没有什么技术上的难度。在就是实验过程中防止RNA污染，个人的经验是操作台干净，不要开风机，使用进口耗材，冰上加样。 我一般反转录都是这样做的 RNA oligo dT或oligo dT-接头 特异性引物（按实验需要确定是否加入） 5’接头引物（按实验需要确定是否加入） 随机小片段random 6等 dNTP DEPC水配到10ul 65度预变性5min后冰上速冷 加入RT酶 RNase抑制剂配到20ul 42度1.5H 出来的cDNA一般都能符合要求 具体不明白的可以参照CLONTECH SMART RACE KIT 说明书上反转录方法 酶和抑制剂我用的promega MMLV和fermentas的 引物和接头都是上海生工合成的 其他东西都是从大连宝生物买的 反转录很简单的 祝你实验成功 |
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jinglove198612楼2011-10-04 10:42:00