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反转录
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| 反转录不是很容易成功么，可是为什么我最近做的反转录效果都很差呢，RNA跑的带很亮，浓度大概0.5~1ug/ul，这个浓度做反转录应该够了呀，而且RNA提完后马上就反转录了，条件是65度5分钟、42度1小时、85度5分钟，可是为什么就是没有cDNA呢，此问题急需得到解决，必当重谢！！！ |
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西瓜
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【答案】应助回帖
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送鲜花一朵
wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 根据楼主反映，理应授予专家指数！Good！ 2011-10-04 09:01:53
送鲜花一朵wanhscn(金币+5, MolEPI+1): 根据楼主反映，理应授予专家指数！Good！ 2011-10-04 09:01:53
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跟您切磋下，呵呵： 一，您说的3楼（实际是4楼啦）有道理的，可以通过western等手段，先确定目的蛋白有一定的表达。要是蛋白没有检测到表达，那RT-PCR就很难做了，甚至没必要做。 二，关于反转录引物，我想唠叨几句。反转移用的引物有三种： 1. Oligo dT:可以跟mRNA的poly A尾巴结合，作为引物，主要适合于长链甚至全长mRNA的引物，但是用Oligo dT不能反转录其他RNA（没有poly A）。 2. 随机引物，常见的是6个碱基的random 6 mers：可以跟所有类型的RNA结合，特别适合丰度低和具有复杂二级结构的模板。 3.基因特异的引物（gene-specific primer）：常用于一步法的反转录PCR（反转录和PCR在同一管里面进行），只反转录特定的片段。跟普通PCR的引物类似，需要知道模板序列。 个人之见，欢迎大家指教，共同学习哈  祝大家假期愉快~ |
11楼2011-10-04 00:21:01
西瓜
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2楼2011-09-30 23:45:23
3楼2011-10-01 12:33:30
4楼2011-10-01 21:04:58