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chendarid0

银虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】关于荧光定量PCR中cdna合成的问题已有7人参与

各位高手请指点啊，小弟在此谢过了
我是做荧光定量pcr的在其上游步骤cdna合成中我用primescript 1st strand cdna synthesis kit 时得到的cdna用内参引物β-actin进行半定量pcr鉴定结果发现目的条带比较淡，但无其他杂带。但是我用他们公司推荐的专门用于荧光定量pcr的可以去除基因组dna污染的试剂盒primescript RT reagent kit with gDNA eraser时可以得到目的条带比较亮，但是却有小于100bp的引物二聚体，呈弥散雾状分布在下方，听师姐说cdna合成后是需要基因组dna的去除的，请问各位高手这是怎么回事
谢谢

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三人行必有我师

1楼2010-10-30 15:17:32

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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

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专业: 疫苗学

★
silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-04 11:57:21

1、严格的提取RNA是最关键的一步，如果有条件就上Qiagen的盒子或者用Trizol等自己按照方法提取。

2、良好的总RNA，如果需要，可以纯化，获取mRNA，纯化的柱子好坏有差异，一般一分钱一分货。

3、可参考一下 fermentas的revert Aid系列的反转录酶，选择适合你的种类。

4、反转录后的效率测定，一定注意严格定量哦！引物的合成，请采用色谱级别。稀释时注意均匀。

5、实时定量的反应条件确定吗？管子等都得考虑上乘的质量哈。