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qidannvzi

银虫 (正式写手)

[求助] 为什么有的样品批不出来东西,DNA检测时挺好的啊

金币全散了,因为我心情超不好,想把钱都花了买衣服,无奈太肥,还要减,还要吃饭。就把金币都花了,这也是我辛辛苦苦天天领的,很少灌水的,还有提心吊胆冒险领来的。我的问题是,我做SCOT的分子标记,DNA检测时,都挺好的,可是为什么PCR后用琼脂糖检测,有的样本一个条带也没有,我很郁闷,跑不出差异也就算了,还跑不出来条带,各位大侠中,有跑过分子标记,品种鉴定之类的,多提宝贵意见,没啥可回报的,就是有金币!
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DARKSEA2522

金虫 (著名写手)

qidannvzi: 回帖置顶 2012-03-19 13:34:36
送花祝福,祝心情会好起来!
14楼2012-03-19 09:20:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

alicejie2005

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-03-19 08:25:09
退火温度高了,建议降低退火温度,做个梯度实验比较好。
另外就是引物设计的时候,5端退火温度尽量高,就是GC碱基多,3端尽量别有GC,最好是T。
引物设计占更大的比重。
希望能对你有帮助。
加油哦
感动你我的开心,是我们共同的冥想
10楼2012-03-19 06:34:51
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zheng~8804

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+20, ★★★很有帮助, 我试试! 2012-03-19 08:12:26
pcr产物没东西
牵扯的因素比较多
建议先把引物单独跑一跑 看引物的条带如何
其次 pcr反应的体系也很重要 (我一般用25ul体系,因人而异)
DNA 1ul
mix  12.5ul
引物 2ul 上下游总共
补足水
分子标记 循环设30个足够
退火温度很重要  引物单子会给出 一般是tm-10度
这世界上有三样东西是别人抢不走的:一是胃里吃紧的东西,二是藏在心里的梦想,三是读进大脑的书!!!
11楼2012-03-19 07:15:45
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-03-20 08:06:56
西瓜: 金币+2, 鼓励应助!荧光定量太贵了,有点不划算哈~ 2012-03-20 11:56:33
建议你做个温度梯度PCR,同时对你的引物做下primer-blast验证引物特异性。如果还弄不出来,你仔细检查下步骤不会是跑胶忘加EB了吧?实在没结果的话你还可以做下荧光定量PCR,看看扩增曲线怎么样,这样可以实时监测你的PCR产物
18楼2012-03-19 22:33:35
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-20 11:56:44
1 如果是引物的问题,那么你就要从设计的引物中筛选出扩增结果稳定,条带清晰,有多态性的引物
2 如果是PCR的条件问题,那么你就要看下退火温度是否合理,有没有需要加入Mg离子来提高反应的效率
3 如果是样品本身的问题,那么你说DNA是没有问题的,有DNA,但是能否确认标记上了,并且具有这种多态性,还有加样做PCR的时候是不是忘了加模板或者没加到体系里去?
20楼2012-03-20 09:41:46
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普通回帖

水泗晶

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+5, 有帮助 2012-03-19 08:16:44
可能是引物没有设计好,可能是PCR体系没有优化,可能是反应程序没有设定好,尤其是温度,退火温度或者延伸温度。你有做过梯度吗?连带都没有,marker带有吗?
2楼2012-03-18 10:01:54
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yjb3344

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+30, ★★★很有帮助 2012-03-19 08:26:28
pcr产物没东西
牵扯的因素比较多
建议先把引物单独跑一跑 看引物的条带如何
其次 pcr反应的体系也很重要 (我一般用25ul体系,因人而异)
DNA 1ul
mix  12.5ul
引物 2ul 上下游总共
补足水
分子标记 循环设30个足够
退火温度很重要  引物单子会给出 一般是tm-10度
不论在世界的任何角落·都要感到幸福
3楼2012-03-18 18:22:33
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a731705125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+10, ★★★很有帮助, 不是,我喜欢吃油泼面! 2012-03-19 08:18:01
我们用的50ul的体系
上下游各1ul
Temple 1ul
等等
我今天有个pcr也没条带,打算再p一次试试,降低点退火温度。
还有楼主把头像换个呗,是不是想天天看到面条最后看到*心就不想再吃面条了么?
4楼2012-03-18 19:45:11
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祝福
5楼2012-03-18 20:19:28
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yumijenny

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
qidannvzi: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢了! 2012-03-19 08:18:35
PCR没有条带,首先确定是不是药品的问题,可以换一下所有的药品,尤其是酶。如果还是P不出来,有可能是体系不合适或者退火温度太高,可以试一下降低退火温度,但有可能有特异性条带。可以尝试下多加一点Mg离子或者酶。我之前也有段时间PCR总是P不出来,后来药品全换,酶多加了一倍就很顺利了
6楼2012-03-18 23:12:37
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yumijenny

木虫 (小有名气)

上面写错了,非特异性条带,不好意思
7楼2012-03-18 23:14:38
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hxl4054

铁杆木虫 (知名作家)

薛定谔的喵星人

这个我不懂  没金币了给偶发站内信  给你赞助哈
8楼2012-03-18 23:33:43
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9楼2012-03-19 00:09:49
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