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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么有的样品批不出来东西，DNA检测时挺好的啊
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qidannvzi

银虫 (正式写手)

[求助] 为什么有的样品批不出来东西，DNA检测时挺好的啊

金币全散了，因为我心情超不好，想把钱都花了买衣服，无奈太肥，还要减，还要吃饭。就把金币都花了，这也是我辛辛苦苦天天领的，很少灌水的，还有提心吊胆冒险领来的。我的问题是，我做SCOT的分子标记，DNA检测时，都挺好的，可是为什么PCR后用琼脂糖检测，有的样本一个条带也没有，我很郁闷，跑不出差异也就算了，还跑不出来条带，各位大侠中，有跑过分子标记，品种鉴定之类的，多提宝贵意见，没啥可回报的，就是有金币！
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准备跨新年！
1楼 2012-03-17 21:43:30
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回帖置顶 ( 共有1个 )

DARKSEA2522

金虫 (著名写手)
qidannvzi: 回帖置顶 2012-03-19 13:34:36
送花祝福，祝心情会好起来！
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14楼2012-03-19 09:20:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

alicejie2005

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-03-19 08:25:09
退火温度高了，建议降低退火温度，做个梯度实验比较好。
另外就是引物设计的时候，5端退火温度尽量高，就是GC碱基多，3端尽量别有GC，最好是T。
引物设计占更大的比重。
希望能对你有帮助。
加油哦
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感动你我的开心，是我们共同的冥想
10楼2012-03-19 06:34:51
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zheng~8804

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+20, ★★★很有帮助, 我试试！ 2012-03-19 08:12:26
pcr产物没东西
牵扯的因素比较多
建议先把引物单独跑一跑 看引物的条带如何
其次 pcr反应的体系也很重要 （我一般用25ul体系，因人而异）
DNA 1ul
mix  12.5ul
引物 2ul 上下游总共
补足水
分子标记 循环设30个足够
退火温度很重要  引物单子会给出 一般是tm-10度
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这世界上有三样东西是别人抢不走的：一是胃里吃紧的东西，二是藏在心里的梦想，三是读进大脑的书！！！
11楼2012-03-19 07:15:45
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+10, ★★★很有帮助 2012-03-20 08:06:56
西瓜: 金币+2, 鼓励应助！荧光定量太贵了，有点不划算哈~ 2012-03-20 11:56:33
建议你做个温度梯度PCR，同时对你的引物做下primer-blast验证引物特异性。如果还弄不出来，你仔细检查下步骤不会是跑胶忘加EB了吧？实在没结果的话你还可以做下荧光定量PCR，看看扩增曲线怎么样，这样可以实时监测你的PCR产物
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18楼2012-03-19 22:33:35
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-03-20 11:56:44
1 如果是引物的问题，那么你就要从设计的引物中筛选出扩增结果稳定，条带清晰，有多态性的引物
2 如果是PCR的条件问题，那么你就要看下退火温度是否合理，有没有需要加入Mg离子来提高反应的效率
3 如果是样品本身的问题，那么你说DNA是没有问题的，有DNA，但是能否确认标记上了，并且具有这种多态性，还有加样做PCR的时候是不是忘了加模板或者没加到体系里去？
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20楼2012-03-20 09:41:46
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普通回帖

水泗晶

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+5, ★有帮助 2012-03-19 08:16:44
可能是引物没有设计好，可能是PCR体系没有优化，可能是反应程序没有设定好，尤其是温度，退火温度或者延伸温度。你有做过梯度吗？连带都没有，marker带有吗？
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2楼2012-03-18 10:01:54
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yjb3344

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+30, ★★★很有帮助 2012-03-19 08:26:28
pcr产物没东西
牵扯的因素比较多
建议先把引物单独跑一跑 看引物的条带如何
其次 pcr反应的体系也很重要 （我一般用25ul体系，因人而异）
DNA 1ul
mix  12.5ul
引物 2ul 上下游总共
补足水
分子标记 循环设30个足够
退火温度很重要  引物单子会给出 一般是tm-10度
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不论在世界的任何角落·都要感到幸福
3楼2012-03-18 18:22:33
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a731705125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+10, ★★★很有帮助, 不是，我喜欢吃油泼面！ 2012-03-19 08:18:01
我们用的50ul的体系
上下游各1ul
Temple 1ul
等等
我今天有个pcr也没条带，打算再p一次试试，降低点退火温度。
还有楼主把头像换个呗，是不是想天天看到面条最后看到*心就不想再吃面条了么？
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4楼2012-03-18 19:45:11
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wangdezhou84
祝福
5楼2012-03-18 20:19:28
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yumijenny

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
qidannvzi: 金币+20, ★★★很有帮助, 多谢了！ 2012-03-19 08:18:35
PCR没有条带，首先确定是不是药品的问题，可以换一下所有的药品，尤其是酶。如果还是P不出来，有可能是体系不合适或者退火温度太高，可以试一下降低退火温度，但有可能有特异性条带。可以尝试下多加一点Mg离子或者酶。我之前也有段时间PCR总是P不出来，后来药品全换，酶多加了一倍就很顺利了
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6楼2012-03-18 23:12:37
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yumijenny

木虫 (小有名气)
上面写错了，非特异性条带，不好意思
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7楼2012-03-18 23:14:38
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hxl4054

铁杆木虫 (知名作家)

薛定谔的喵星人
这个我不懂  没金币了给偶发站内信  给你赞助哈
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8楼2012-03-18 23:33:43
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missyou8326
9楼2012-03-19 00:09:49
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