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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】引物特异性PCR（SSP-PCR）检测SNP，是不是容易出现杂带呀
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yhy322

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】引物特异性PCR（SSP-PCR）检测SNP，是不是容易出现杂带呀已有6人参与

用引物特异性PCR检测单点突变，下游引物一样，上游引物只差一个碱基。分别在两个体系（体系1和体系2）中进行PCR，我觉得结果应该是纯合子只有在体系1或体系2二者之一中有条带，杂合子两个体系都有带，且为同样亮度的。
    但为什么我的结果总会是在一个体系中有清晰条带，另一体系中也有模糊条带。是不是这种方法容易出现这种情况，可不可以认为只要不是同等亮度的都可判断为纯合型？
    请各位大侠指教！非常感谢！
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1楼2011-04-08 09:36:02
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xwsooo

银虫 (小有名气)
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1949stone(金币+4): 很可爱的回复 很有用 2011-04-08 11:14:33
唔，握爪，你跟我做的好像啊。。。“下游引物一样，上游引物只差一个碱基”。我在两个体系中也遇到过这样的问题，你可以提高退火温度或加DMSO看看，可能有些是非特异性条带。。。我原先以为做这个特异性很难保证，但现在看来特异性还是可以的，没有遇到什么非特异性条带（我现在已经合成一个体系了）
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2楼2011-04-08 10:19:16
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Starring

新虫 (初入文坛)
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1949stone(金币+2): 鼓励 2011-04-08 11:14:42
我和你用的方法是一样的，检测出来的都是杂合子，我都快要崩溃了，不知道是不是方法有问题。
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3楼2011-04-08 10:30:55
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xwsooo

银虫 (小有名气)
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嗯，看来这个问题还有共性，值得讨论一下~~~~
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4楼2011-04-08 12:05:12
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Starring

新虫 (初入文坛)
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dhd997: 你可以引用回复，你想让谁回答，他就可以看到了 2011-05-10 08:45:50
是啊，我的问题就是不管是在哪个体系中，P出来的产物条带都很亮，所以就想测序一下，但是不知道测序后如何判断突变位点的基因型是怎样的情况。
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5楼2011-04-08 13:12:15
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yj-lzx

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小木虫生化熊

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dhd997(金币+6): 跑的还不错了 2011-04-09 08:44:26
这个的话，你的引物设计的要给力啊~~~
我最近用的方法跟楼主的也差不多~~~
不过有的也不好判啊~~~
那些不清楚的不晓得是不是杂带


[ Last edited by yj-lzx on 2011-4-8 at 13:42 ]
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曾经的你/以为只要带着那把青春的长剑和赤子的良心就可以说服自己不出卖理想的灵魂/在最寂寞和不得不流泪的晚上/即使连自己都在笑自己傻/依然拔出怀中的长剑~~~
6楼2011-04-08 13:41:06
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yj-lzx

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫生化熊

优秀版主
对了~~~
我的是两对引物在一个反应体系中~~~
touch down pcr~~~
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曾经的你/以为只要带着那把青春的长剑和赤子的良心就可以说服自己不出卖理想的灵魂/在最寂寞和不得不流泪的晚上/即使连自己都在笑自己傻/依然拔出怀中的长剑~~~
7楼2011-04-08 13:44:23
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yhy322

铁虫 (初入文坛)
谢谢，各位。
我的两个产物大小一样600多bp，不能放到一个体系中。每个体系也都有质控带，指控带很清晰250bp.提高退火温度1度后指控带变弱了。感觉反映条带变化不明显！
下一次加DMSO试试
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8楼2011-04-08 14:09:41
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Starring

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
Originally posted by yj-lzx at 2011-04-08 13:41:06:
这个的话，你的引物设计的要给力啊~~~
我最近用的方法跟楼主的也差不多~~~
不过有的也不好判啊~~~
那些不清楚的不晓得是不是杂带


[ Last edited by yj-l ...

这个问题很难说啊。我咨询过好多人，都觉得那种别太清楚的也算是P出来东西啦
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9楼2011-04-08 19:14:09
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yj-lzx

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小木虫生化熊

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dhd997(金币+2): 啊，没想到啊，现在搞专业了。欢迎继续！ 2011-04-09 08:45:11
引用回帖:
Originally posted by Starring at 2011-04-08 19:14:09:
这个问题很难说啊。我咨询过好多人，都觉得那种别太清楚的也算是P出来东西啦

那就是杂带咯~~~或者说引物还是不行，分辨变粗出来
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曾经的你/以为只要带着那把青春的长剑和赤子的良心就可以说服自己不出卖理想的灵魂/在最寂寞和不得不流泪的晚上/即使连自己都在笑自己傻/依然拔出怀中的长剑~~~
10楼2011-04-08 20:33:43
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