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张俊亚

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求助PCR杂带过多! 已有7人参与

我是从污水处理厂污泥中提取的总DNA,用来P MXAF基因的保守区的500bp左右的序列!,可是每次都是杂带过多,并且都是很靠近目的条带!请问下PCR杂带过多的话应该去调节哪些的用量?谢谢!
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张俊亚

木虫 (正式写手)

帮忙下,谢谢啦!总要有个方向才好!
2楼2010-08-10 15:48:45
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励一下。 2010-08-10 21:03:36
PCR结果不好的原因多种多样,但万变不离其踪,减少非特异扩增可以改变引物序列,提高退火温度,减少模板的量;也可以用热启动的方法。祝lz好运!
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-08-10 15:58:51
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张俊亚

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-08-10 15:58:51:
PCR结果不好的原因多种多样,但万变不离其踪,减少非特异扩增可以改变引物序列,提高退火温度,减少模板的量;也可以用热启动的方法。祝lz好运!

多谢,我尝试一下,减少模板用量吧!退火温度,我用的58度应该差不多,但是如果模板过多不应该有二聚体存在吗  ?我的没有二聚体,就是很明显很多的杂带!
4楼2010-08-10 16:01:41
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fang8596

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可以试试Tm梯度扫一下~
5楼2010-08-10 16:07:00
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fykxy_206

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我是从污水处理厂污泥中提取的总DNA
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2288935&fpage=1

基因组DNA是单一的吗?
看你的意思好像不是,那就有可能在差不多相同的位置出现条带。因为很多不同的DNA自然能P出不同的条带。
6楼2010-08-10 16:11:33
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
极有可能是几种不同的微生物均有此基因,但序列略有差异,恰好你设计的引物都能将他们扩出来。建议延长下电泳时间,将各个条带都切胶回收连接测序。此外,除了楼上说的方法外,可考虑降低镁离子浓度来提高扩增特异性。
7楼2010-08-10 18:30:37
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MarchZR

银虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
提高退火温度,采用热启动PCR(热启动PCR酶扩增即可)
8楼2015-07-06 17:20:34
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
二聚体是指引物两两结合形成的小bp弥散条带。跟你模板还多少无关。你这个估计还是引物特异性不够引起的,去blast下

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2015-07-06 18:26:21
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