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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】求助PCR杂带过多！
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张俊亚

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】求助PCR杂带过多！ 已有7人参与

我是从污水处理厂污泥中提取的总DNA，用来P MXAF基因的保守区的500bp左右的序列！，可是每次都是杂带过多，并且都是很靠近目的条带！请问下PCR杂带过多的话应该去调节哪些的用量？谢谢！
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1楼 2010-08-10 15:46:50
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张俊亚

木虫 (正式写手)
帮忙下，谢谢啦！总要有个方向才好！
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2楼2010-08-10 15:48:45
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励一下。 2010-08-10 21:03:36
PCR结果不好的原因多种多样，但万变不离其踪，减少非特异扩增可以改变引物序列，提高退火温度，减少模板的量；也可以用热启动的方法。祝lz好运！
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2010-08-10 15:58:51
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张俊亚

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-08-10 15:58:51:
PCR结果不好的原因多种多样，但万变不离其踪，减少非特异扩增可以改变引物序列，提高退火温度，减少模板的量；也可以用热启动的方法。祝lz好运！

多谢，我尝试一下，减少模板用量吧！退火温度，我用的58度应该差不多，但是如果模板过多不应该有二聚体存在吗  ？我的没有二聚体，就是很明显很多的杂带！
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4楼2010-08-10 16:01:41
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fang8596

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以试试Tm梯度扫一下～
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5楼2010-08-10 16:07:00
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fykxy_206

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我是从污水处理厂污泥中提取的总DNA
本文来自: 小木虫论坛 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2288935&fpage=1

基因组DNA是单一的吗？
看你的意思好像不是，那就有可能在差不多相同的位置出现条带。因为很多不同的DNA自然能P出不同的条带。
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6楼2010-08-10 16:11:33
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
极有可能是几种不同的微生物均有此基因，但序列略有差异，恰好你设计的引物都能将他们扩出来。建议延长下电泳时间，将各个条带都切胶回收连接测序。此外，除了楼上说的方法外，可考虑降低镁离子浓度来提高扩增特异性。
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7楼2010-08-10 18:30:37
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MarchZR

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
提高退火温度，采用热启动PCR（热启动PCR酶扩增即可）
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8楼2015-07-06 17:20:34
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snoopytbw

荣誉版主 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
二聚体是指引物两两结合形成的小bp弥散条带。跟你模板还多少无关。你这个估计还是引物特异性不够引起的，去blast下

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2015-07-06 18:26:21
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