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yangjianchen

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】real time PCR如何去掉杂峰

在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰，这个峰与需要的峰是相连的，请问是什么原因？如何解决！

谢谢
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1楼2011-04-01 17:25:14
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-01 20:02:24
yangjianchen(金币+1): 非常感谢，按照你的方法我再尝试下 2011-04-03 10:10:33
yangjianchen(金币+1): 2011-04-26 00:53:22
这个杂峰可能是非特异扩增的产物。可以尝试提高退火温度（如2℃），缩短延伸时间，降低引物浓度，降低镁离子浓度等方法。如不奏效，恐怕得重新设计引物了，尽量避免错配、引物二聚体的形成和发夹结构。
还有一个可能是基因组DNA的污染。
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2楼2011-04-01 19:24:34
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by yangjianchen at 2011-04-01 17:25:14:
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰，这个峰与需要的峰是相连的，请问是什么原因？如何解决！

谢谢

……今晚做了个Real-time PCR，出现跟你一样的情况了，并且阴性对照也有扩增，且阴性对照的峰还跟样品的峰位置一样，得出的定量结果也跟预期的差好远。估计我的引物也不好。明天把退火温度从55提高到60试试……God bless me……
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3楼2011-04-26 00:56:23
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
Originally posted by yangjianchen at 2011-04-01 17:25:14:
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰，这个峰与需要的峰是相连的，请问是什么原因？如何解决！

谢谢

楼主你问题解决了没？呵呵~
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4楼2011-04-26 00:57:25
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david_xmu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+3): good 2011-04-26 18:56:22
在设计引物的时候，注意一下扩增产物的大小，虽然说扩增产物越小，PCR效率越高，但是太小的话，比如70~80bp左右，跟引物二聚体差不多大，这样即使产生了引物二聚体，也无法通过溶解曲线或者跑胶来区分开，我一般都设计成120~150 bp左右吧。仅供参考。
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5楼2011-04-26 05:54:56
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david_xmu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 是滴，一般有问题的话我也会去跑胶看看。 2011-04-26 20:06:24
引用回帖:
Originally posted by yangjianchen at 2011-04-01 17:25:14:
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰，这个峰与需要的峰是相连的，请问是什么原因？如何解决！

谢谢

有没有把PCR产物拿去跑胶看看，如果跑胶的结果是一条带，我觉得还是可以的。有的时候溶解曲线也不是那么准确的。
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6楼2011-04-26 05:56:51
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475502411

铜虫 (著名写手)
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 有可能 2011-04-26 19:55:13
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-01 19:24:34:
这个杂峰可能是非特异扩增的产物。可以尝试提高退火温度（如2℃），缩短延伸时间，降低引物浓度，降低镁离子浓度等方法。如不奏效，恐怕得重新设计引物了，尽量避免错配、引物二聚体的形成和发夹结构。
还有一个 ...

我之前也出现过阴性出现峰的情况，可能是引物或者是水污染了
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7楼2011-04-26 19:13:16
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1122979楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-04-26 00:57:25
楼主你问题解决了没？呵呵~...

我感觉可能是试剂的问题了，对于同样的模板和引物，宝生物的特异性要比天根好一些，当然成本也要高啦。
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8楼2012-07-09 11:06:24
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1123035楼: Originally posted by david_xmu at 2011-04-26 05:56:51
有没有把PCR产物拿去跑胶看看，如果跑胶的结果是一条带，我觉得还是可以的。有的时候溶解曲线也不是那么准确的。...

但是说是这么说，但是大家公认的还是要看溶解曲线啊
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9楼2012-07-09 11:07:10
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1125844楼: Originally posted by 475502411 at 2011-04-26 19:13:16
我之前也出现过阴性出现峰的情况，可能是引物或者是水污染了...

阴性出现污染很正常的，只是说这个不是阴性
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10楼2012-07-09 11:07:41
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
1270037楼: Originally posted by yangjianchen at 2012-07-09 11:06:24
我感觉可能是试剂的问题了，对于同样的模板和引物，宝生物的特异性要比天根好一些，当然成本也要高啦。...

搞定了就好
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11楼2012-07-09 12:15:36
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yangjianchen

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
1270046楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-07-09 12:15:36
搞定了就好...

嗯嗯嗯，谢啦
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12楼2012-07-12 17:33:21
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