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【求助/交流】real time PCR如何去掉杂峰
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yangjianchen
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[交流]
【求助/交流】real time PCR如何去掉杂峰
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰,这个峰与需要的峰是相连的,请问是什么原因?如何解决!
谢谢
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2011-04-01 17:25:14
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dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-04-01 20:02:24
yangjianchen(金币+1): 非常感谢,按照你的方法我再尝试下 2011-04-03 10:10:33
yangjianchen(金币+1): 2011-04-26 00:53:22
这个杂峰可能是非特异扩增的产物。可以尝试提高退火温度(如2℃),缩短延伸时间,降低引物浓度,降低镁离子浓度等方法。如不奏效,恐怕得重新设计引物了,尽量避免错配、引物二聚体的形成和发夹结构。
还有一个可能是基因组DNA的污染。
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2011-04-01 19:24:34
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Originally posted by
yangjianchen
at 2011-04-01 17:25:14:
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰,这个峰与需要的峰是相连的,请问是什么原因?如何解决!
谢谢
……
今晚做了个Real-time PCR,出现跟你一样的情况了,并且阴性对照也有扩增,且阴性对照的峰还跟样品的峰位置一样,得出的定量结果也跟预期的差好远。估计我的引物也不好。明天把退火温度从55提高到60试试……God bless me……
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3楼
2011-04-26 00:56:23
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Originally posted by
yangjianchen
at 2011-04-01 17:25:14:
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰,这个峰与需要的峰是相连的,请问是什么原因?如何解决!
谢谢
楼主你问题解决了没?呵呵~
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4楼
2011-04-26 00:57:25
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dhd997(金币+3): good 2011-04-26 18:56:22
在设计引物的时候,注意一下扩增产物的大小,虽然说扩增产物越小,PCR效率越高,但是太小的话,比如70~80bp左右,跟引物二聚体差不多大,这样即使产生了引物二聚体,也无法通过溶解曲线或者跑胶来区分开,我一般都设计成120~150 bp左右吧。仅供参考。
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5楼
2011-04-26 05:54:56
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西瓜(金币+3): 是滴,一般有问题的话我也会去跑胶看看。 2011-04-26 20:06:24
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Originally posted by
yangjianchen
at 2011-04-01 17:25:14:
在做定量PCR的时候溶解曲线中所要的峰旁边出现了一个稍低一点的峰,这个峰与需要的峰是相连的,请问是什么原因?如何解决!
谢谢
有没有把PCR产物拿去跑胶看看,如果跑胶的结果是一条带,我觉得还是可以的。有的时候溶解曲线也不是那么准确的。
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6楼
2011-04-26 05:56:51
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西瓜(金币+2): 有可能 2011-04-26 19:55:13
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Originally posted by
西瓜
at 2011-04-01 19:24:34:
这个杂峰可能是非特异扩增的产物。可以尝试提高退火温度(如2℃),缩短延伸时间,降低引物浓度,降低镁离子浓度等方法。如不奏效,恐怕得重新设计引物了,尽量避免错配、引物二聚体的形成和发夹结构。
还有一个 ...
我之前也出现过阴性出现峰的情况,可能是引物或者是水污染了
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7楼
2011-04-26 19:13:16
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1122979楼
:
Originally posted by
西瓜
at 2011-04-26 00:57:25
楼主你问题解决了没?呵呵~...
我感觉可能是试剂的问题了,对于同样的模板和引物,宝生物的特异性要比天根好一些,当然成本也要高啦。
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8楼
2012-07-09 11:06:24
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yangjianchen
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1123035楼
:
Originally posted by
david_xmu
at 2011-04-26 05:56:51
有没有把PCR产物拿去跑胶看看,如果跑胶的结果是一条带,我觉得还是可以的。有的时候溶解曲线也不是那么准确的。...
但是说是这么说,但是大家公认的还是要看溶解曲线啊
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9楼
2012-07-09 11:07:10
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yangjianchen
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1125844楼
:
Originally posted by
475502411
at 2011-04-26 19:13:16
我之前也出现过阴性出现峰的情况,可能是引物或者是水污染了...
阴性出现污染很正常的,只是说这个不是阴性
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2012-07-09 11:07:41
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1270037楼
:
Originally posted by
yangjianchen
at 2012-07-09 11:06:24
我感觉可能是试剂的问题了,对于同样的模板和引物,宝生物的特异性要比天根好一些,当然成本也要高啦。...
搞定了就好
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11楼
2012-07-09 12:15:36
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1270046楼
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Originally posted by
西瓜
at 2012-07-09 12:15:36
搞定了就好
...
嗯嗯嗯,谢啦
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12楼
2012-07-12 17:33:21
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