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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于real-time PCR温度优化的问题
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nininini

银虫 (小有名气)

[求助] 关于real-time PCR温度优化的问题

第一次实验温度Tm=58度，Cp值22左右，后来相同体系，Tm=66度，结果Cp值降到了9左右，三四个基因都是这样，请问这是什么原因呢，结果可靠吗？
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1楼 2011-05-28 10:52:28
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

nininini(金币+5): 谢谢详细回复 2011-05-28 11:35:00
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-05-28 10:52:28:
第一次实验温度Tm=58度，Cp值22左右，后来相同体系，Tm=66度，结果Cp值降到了9左右，三四个基因都是这样，请问这是什么原因呢，结果可靠吗？

感觉Cp=22太高了。
虽然Cp值多少都是现实情况的反应。跟Cp有关的因素其实也就是PCR反应产物量的影响因素。比如:模板量，扩增效率等。也就是说Cp和产物的量相关。
而Tm主要和精度有关（当然也会影响扩增效率以及扩增），但在荧光定量PCR中我们调节Tm是为了更单一的产物，特别是在用染料法的时候。也就是说Tm和精度有关。

你前后实验都有重复试过吗？如果都是相同条件只是Tm不同且是在有一定重复性下得到的可信结果。
那我觉得你要做：
1.扩增效率考证。。做一个在不同温度下的扩增效率对比。
2.试剂确定没问题。
3.程序设置与试剂相符合。有些公司酶是要热变性，有些快速酶，有些是标准酶。
4.扩大体系，抬高平台期和基线期距离，看看与原体系差别。理论上CT值是一样的。
5.看是否有背景污染。用水做对照。

个人感觉，只是Tm变，Cp差太大了，应该是扩增效率差别很大造成的。
另外：
1.CT差别有多大？
2.你是两步法还是三步法PCR？

你的情况我没遇到过。顺便学习。
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2楼2011-05-28 11:24:30
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-28 11:24:30:
感觉Cp=22太高了。
虽然Cp值多少都是现实情况的反应。跟Cp有关的因素其实也就是PCR反应产物量的影响因素。比如:模板量，扩增效率等。也就是说Cp和产物的量相关。
而Tm主要和精度有关（当然也会影响扩增效率以 ...

谢谢详细的解答，试剂应该没什么问题，一起做的其他基因都正常，因为是初始摸条件，所以没做平行，Tm=58度时以其中的一个基因做标准曲线，扩增效率为92%，Tm=66度的没做标准曲线。但觉得扩增效率不应该会有这么大的影响，我觉得您的建议，测定不同温度的扩增效率很有意义~~希望继续讨论~~
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3楼2011-05-28 11:38:23
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-28 11:24:30:
感觉Cp=22太高了。
虽然Cp值多少都是现实情况的反应。跟Cp有关的因素其实也就是PCR反应产物量的影响因素。比如:模板量，扩增效率等。也就是说Cp和产物的量相关。
而Tm主要和精度有关（当然也会影响扩增效率以 ...

另外，两次Cp值相差13，
没明白您说的二步三步什么意思，我是体外反转，用cDNA为模板，程序就是变性退火延伸三步法，不知道您还指哪些方面？
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4楼2011-05-28 11:41:31
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

nininini(金币+1): 2011-07-18 08:51:40
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-05-28 11:41:31:
另外，两次Cp值相差13，
没明白您说的二步三步什么意思，我是体外反转，用cDNA为模板，程序就是变性退火延伸三步法，不知道您还指哪些方面？

PCR过程，三步法就是：变性退火延伸  二步就是：变性 退火+延伸
比方：我的程序是   ：  95°c 5s    60°c 30s   40个循环。
三步法扩增效率高些，两步法副产物相对少些。

你CT差得大吗？
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5楼2011-05-28 15:37:11
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nininini

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by adslye at 2011-05-28 15:37:11:
PCR过程，三步法就是：变性退火延伸  二步就是：变性 退火+延伸
比方：我的程序是   ：  95°c 5s    60°c 30s   40个循环。
三步法扩增效率高些，两步法副产物相对少些。

你CT差得大吗？

那我的是三步法，95°c 5s ，58度或66度 20s，72度 30s 其中一个差13，另外两三个差10左右
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6楼2011-05-28 15:53:33
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

nininini(金币+3): 2011-05-28 17:53:29
nininini(金币+1): 2011-07-18 08:51:46
引用回帖:
Originally posted by nininini at 2011-05-28 15:53:33:
那我的是三步法，95°c 5s ，58度或66度 20s，72度 30s 其中一个差13，另外两三个差10左右

你的意思是同一基因，同一体系，只是退火温度不同。CT值差了10以上对吧？
那你这个肯定有问题。3.3个CT基本就是模板量差10倍。

你是探针法还是染料法。确定没有副产物吧?  CT差10有可能是产物和引物二聚体的差别。

建议你换2步法P下。 95°5s  66°30s 看下。  你的引物退火温度多少？为什么要选这两个温度？如果你要摸条件，那就直接做个梯度，你这样2个温度做下来没意义。

强烈建议做个NTC组，确认下2种温度下的产物，看有没有非特异性产物。
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7楼2011-05-28 16:36:26
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