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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » PCR退火温度
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bio_linda

[交流] PCR退火温度 已有2人参与

各位虫友大家好！
    我拿到的引物退火温度一个是69度，一个62度，PCR程序退火温度设多少合适呀？我做的梯度是从52到65的，低温时在2000和1500左右有微弱的条带（目的条带900左右），中间温度扩出来的在250到100之间有明亮的引物二聚体，高温没有任何条带。
    我想再重新p一次，请问大家，从这种结果看，我的退火温度取什么范围的梯度合适呀？还是要重新设计引物？
    O(∩_∩)O谢谢~~
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1楼 2009-08-13 19:09:56
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

试验次数增加

★ ★ ★
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amisking(金币+0,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-14 19:08
amisking(金币+2,VIP+0): 8-14 19:08
要想成功你就得亲身经历，多试几次就行了，我做了不知道多少次！最终才确定好温度，别怕花老板的钱，可你老板要是经费很少的话，就算了。我P一个基因花了俩月，天天PCR，刚开始是调适温度和程序，而且还和机器有关，用惯了那台机器就不要再换了。
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6楼2009-08-14 12:15:52
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普通回帖

sgba0307

铁虫 (小有名气)
★
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没有出现过目的条带》？改变模板的浓度试试
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2楼2009-08-13 19:39:26
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zhang6871

银虫 (正式写手)
★
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这么情况我们也遇到过，不过没有这么高的Tm值。我们一般是取中间温度，比如你这对引物，取64摄氏度应该可以扩出来的，但是估计会有杂带出现的。
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过于功利，浮躁，布满灰尘的心都是创新的杀手!多记，心静，多动手，贴近大自然!
3楼2009-08-14 01:03:51
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genetics183

木虫 (正式写手)
应该避免两条引物Tm值相差太大。
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士虽有学，而行为本焉。
4楼2009-08-14 09:12:44
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xxy11

铁杆木虫 (小有名气)
★
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引物的退火温度相差不要超过2度
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5楼2009-08-14 11:27:47
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huij007

铜虫 (小有名气)
★
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最近也在PCR，开始摸索条件 挺郁闷的，不知道各种成分放多少？
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7楼2009-08-14 16:26:43
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smallcat227

木虫 (著名写手)
根据楼主的描述似乎该重新设计引物
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8楼2009-08-14 17:58:45
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shensc727

金虫 (小有名气)
★
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退火温度太高了，相差也太大，建议重新设计引物！
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9楼2009-08-14 18:27:26
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
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楼主，可以的话，把你的反应条件也说下。。。
我做PCR多，有些经验，一般两次就能把东西扩出来。。
你的退火温度我建议选55到60之间。
按照你说的情况，我认为的你的延伸时间有点过高了。如果你的模板是质粒，应该很轻松就可以扩了。。如果你的模板是真核基因组的话，可以加一些DMSO。
我建议你的反应条件可以这样:
95度，3分
95度20秒，60度30秒，72度1分，（循环数你要看你的模板浓度自己定，一般真核基因组用30到35个循环）
72度3分。
切记，如果是真核基因组的话，加一些DMSO。
如果还不行，可以尝试TOUCH DOWN PCR。。。即退火温度从65度到55度每个循环降一度，再55度退火保持20多个循环。。
祝顺利
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10楼2009-08-14 19:47:48
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