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[交流] PCR退火温度已有2人参与

各位虫友大家好！
我拿到的引物退火温度一个是69度，一个62度，PCR程序退火温度设多少合适呀？我做的梯度是从52到65的，低温时在2000和1500左右有微弱的条带（目的条带900左右），中间温度扩出来的在250到100之间有明亮的引物二聚体，高温没有任何条带。
我想再重新p一次，请问大家，从这种结果看，我的退火温度取什么范围的梯度合适呀？还是要重新设计引物？
O(∩_∩)O谢谢~~

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1楼2009-08-13 19:09:56

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spiderboy

金虫 (正式写手)

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专业: 生物化学

★
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楼主，可以的话，把你的反应条件也说下。。。
我做PCR多，有些经验，一般两次就能把东西扩出来。。
你的退火温度我建议选55到60之间。
按照你说的情况，我认为的你的延伸时间有点过高了。如果你的模板是质粒，应该很轻松就可以扩了。。如果你的模板是真核基因组的话，可以加一些DMSO。
我建议你的反应条件可以这样:
95度，3分
95度20秒，60度30秒，72度1分，（循环数你要看你的模板浓度自己定，一般真核基因组用30到35个循环）
72度3分。
切记，如果是真核基因组的话，加一些DMSO。
如果还不行，可以尝试TOUCH DOWN PCR。。。即退火温度从65度到55度每个循环降一度，再55度退火保持20多个循环。。
祝顺利