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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】做realtime-PCR,退火温度很重要吗?

要做realtime-PCR,需不需要摸索最适退火温度? 望指点
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love_st

金虫 (著名写手)


2楼2011-01-21 10:43:52
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-01-21 10:43:52:
需要

为什么呀? 怎么摸索呢?是不是要先设个温度梯度做个半定量PCR
3楼2011-01-21 10:46:29
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xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
非常必要摸索条件
因为退火温度能够影响特异性以及PCR效率
4楼2011-01-21 11:09:25
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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
我们实验室都没有摸索,一套程序做所有,但是有些特殊的引物,比如TM值特别的高的,还是会摸索一下提高退火温度看看,但是普通的引物我们一般都那么一套程序下来挺好的
5楼2011-01-21 12:49:23
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zoujin129

禁虫 (知名作家)


xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽

6楼2011-01-21 12:54:06
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j2

木虫 (正式写手)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
做个梯度吧,没有非特异片段最重要
9楼2011-01-21 14:34:12
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bigboy123

铜虫 (小有名气)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
可以象征性的摸一下,一般没什么大用。
10楼2011-01-21 15:13:34
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xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
有必要,做个梯度看看
11楼2011-01-21 15:49:56
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xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
ofcourse,二聚体是致命的
12楼2011-01-21 15:52:44
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翱宇

禁虫 (正式写手)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
我在帮个国外的同学补个实验,就有16个基因的Realtime PCR,还是水稻的。第一轮只有一小半引物可以用,第二轮9个引物4个能用。水稻的GC含量很高,需要高的退火温度,我一般设计引物Tm在70度,退火温度在65度。加有5%的DMSO。

我自己的课题已经做完毕业了,是拟南芥的基因,按照以上的操作还是很好做的,一般10个基因的引物,只有一两个出现意外。
13楼2011-01-21 16:47:13
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


到底需不需要呢
14楼2011-01-21 21:20:59
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yipingming

木虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
当然需要~\(≧▽≦)/~啦啦啦
15楼2012-04-05 22:28:02
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adili

铁虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
497630楼: Originally posted by xnbioinfor at 2011-01-21 10:42:28:
要做realtime-PCR,需不需要摸索最适退火温度? 望指点

需要摸索,在引物合成之后报告单上的退火温度减去3-5度,也可做个温度梯度。温度太低容易产生非特异性的扩增
16楼2012-04-25 16:31:46
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简单回复
Jeff_tian7楼
2011-01-21 13:09   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
5501916168楼
2011-01-21 13:16   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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