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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做realtime-PCR，退火温度很重要吗？
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】做realtime-PCR，退火温度很重要吗？

要做realtime-PCR，需不需要摸索最适退火温度？ 望指点
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1楼 2011-01-21 10:42:28
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love_st

金虫 (著名写手)
需要
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2楼2011-01-21 10:43:52
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-01-21 10:43:52:
需要

为什么呀？ 怎么摸索呢？是不是要先设个温度梯度做个半定量PCR
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3楼2011-01-21 10:46:29
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
非常必要摸索条件
因为退火温度能够影响特异性以及PCR效率
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4楼2011-01-21 11:09:25
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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
我们实验室都没有摸索，一套程序做所有，但是有些特殊的引物，比如TM值特别的高的，还是会摸索一下提高退火温度看看，但是普通的引物我们一般都那么一套程序下来挺好的
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5楼2011-01-21 12:49:23
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zoujin129

禁虫 (知名作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
本帖内容被屏蔽
6楼2011-01-21 12:54:06
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j2

木虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
做个梯度吧，没有非特异片段最重要
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9楼2011-01-21 14:34:12
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
可以象征性的摸一下，一般没什么大用。
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10楼2011-01-21 15:13:34
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starseacow

专家顾问 (职业作家)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
有必要，做个梯度看看
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11楼2011-01-21 15:49:56
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
ofcourse，二聚体是致命的
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12楼2011-01-21 15:52:44
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翱宇

禁虫 (正式写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
我在帮个国外的同学补个实验，就有16个基因的Realtime PCR,还是水稻的。第一轮只有一小半引物可以用，第二轮9个引物4个能用。水稻的GC含量很高，需要高的退火温度，我一般设计引物Tm在70度，退火温度在65度。加有5%的DMSO。

我自己的课题已经做完毕业了，是拟南芥的基因，按照以上的操作还是很好做的，一般10个基因的引物，只有一两个出现意外。
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13楼2011-01-21 16:47:13
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
到底需不需要呢
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14楼2011-01-21 21:20:59
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yipingming

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
当然需要~\(≧▽≦)/~啦啦啦
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15楼2012-04-05 22:28:02
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adili

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
497630楼: Originally posted by xnbioinfor at 2011-01-21 10:42:28:
要做realtime-PCR，需不需要摸索最适退火温度？ 望指点

需要摸索，在引物合成之后报告单上的退火温度减去3-5度，也可做个温度梯度。温度太低容易产生非特异性的扩增
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16楼2012-04-25 16:31:46
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简单回复
Jeff_tian7楼
2011-01-21 13:09   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
5501916168楼
2011-01-21 13:16   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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