[交流] 【求助/交流】做realtime-PCR，退火温度很重要吗？

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1楼2011-01-21 10:42:28

love_st

金虫 (著名写手)

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需要

2楼2011-01-21 10:43:52

xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

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引用回帖:

Originally posted by love_st at 2011-01-21 10:43:52:
需要

为什么呀？怎么摸索呢？是不是要先设个温度梯度做个半定量PCR

赞一下

3楼2011-01-21 10:46:29

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★
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非常必要摸索条件
因为退火温度能够影响特异性以及PCR效率

4楼2011-01-21 11:09:25

zhp1984816

铜虫 (初入文坛)

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★
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我们实验室都没有摸索，一套程序做所有，但是有些特殊的引物，比如TM值特别的高的，还是会摸索一下提高退火温度看看，但是普通的引物我们一般都那么一套程序下来挺好的

5楼2011-01-21 12:49:23

zoujin129

禁虫 (知名作家)

★
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本帖内容被屏蔽

6楼2011-01-21 12:54:06

j2

木虫 (正式写手)

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★
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做个梯度吧，没有非特异片段最重要

9楼2011-01-21 14:34:12

bigboy123

铜虫 (小有名气)

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可以象征性的摸一下，一般没什么大用。

10楼2011-01-21 15:13:34

starseacow

专家顾问 (职业作家)

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有必要，做个梯度看看

11楼2011-01-21 15:49:56

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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ofcourse，二聚体是致命的

12楼2011-01-21 15:52:44

翱宇

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我在帮个国外的同学补个实验，就有16个基因的Realtime PCR,还是水稻的。第一轮只有一小半引物可以用，第二轮9个引物4个能用。水稻的GC含量很高，需要高的退火温度，我一般设计引物Tm在70度，退火温度在65度。加有5%的DMSO。

我自己的课题已经做完毕业了，是拟南芥的基因，按照以上的操作还是很好做的，一般10个基因的引物，只有一两个出现意外。

13楼2011-01-21 16:47:13