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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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侯云hy

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】这退火温度怎么算啊 已有5人参与

各位高手:我设计的引物,上游加了GC夹子,公司给的TM值是86度,下游引物没有夹子。退火温度为53度。这退火温度怎么算啊?谢谢指教
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

按较低的那个算~~
2楼2010-11-28 11:44:37
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yinsongna

金虫 (正式写手)

跑个梯度
3楼2010-11-28 12:36:00
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侯云hy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-11-28 12:36:00:
跑个梯度

具体跑那个温度的梯度啊?我跑了63-53的 什么都没有 有引物二聚体,但不是很亮。
4楼2010-11-28 12:56:31
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侯云hy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-28 11:44:37:
按较低的那个算~~

我跑了53度的,什么都没有。
5楼2010-11-28 12:57:08
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fjt198719

木虫 (著名写手)

永远的菜鸟

这是我第三次回复类似问题了

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励交流! 2010-11-28 15:26:26
本人从来不计算TM值,因为一般都是直接把目的基因全部扩增出来,设计引物都是直接手写,酶切位点当然要用软件分析下才选择的(载体上有,目的基因上无,双酶切效果好点的),扩增200-3000片段全部没得问题。SOE-PCR也没的问题,就是直接融合5个片段也没的问题,设计的中间融合引物都是50bp跟30bp的引物一起扩增,刚刚的(这里引物合成单上写的50bp的引物退火温度都是80度左右,30bp的是65左右,而我扩增的退火温度是57度,可以看出来单子上写的没用)。
本人粗略认为退火温度只与目的菌株的GC含量有关
独YY不如众YY!!!
6楼2010-11-28 13:18:10
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yinsongna

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):很活跃,鼓励 2010-11-28 19:26:41
引用回帖:
Originally posted by 侯云hy at 2010-11-28 12:56:31:

具体跑那个温度的梯度啊?我跑了63-53的 什么都没有 有引物二聚体,但不是很亮。

我一般都是55到70的,除非是模板有问题,通常都能P出来的
7楼2010-11-28 19:07:16
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我们的计算方法 Tm1+Tm2/2 ---5 的值就是理论上的退火温度,但是实际上要在这个值上下浮动几度设定一个pcr温度梯度,摸一下温度,然后再大批量进行扩增!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2010-11-28 22:38:05
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侯云hy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-11-28 22:38:05:
我们的计算方法 Tm1+Tm2/2 ---5 的值就是理论上的退火温度,但是实际上要在这个值上下浮动几度设定一个pcr温度梯度,摸一下温度,然后再大批量进行扩增!

是(tm1+tm2)/2--5么?
9楼2010-11-29 16:27:56
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