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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】这退火温度怎么算啊
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侯云hy

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】这退火温度怎么算啊 已有5人参与

各位高手：我设计的引物，上游加了GC夹子，公司给的TM值是86度，下游引物没有夹子。退火温度为53度。这退火温度怎么算啊？谢谢指教
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1楼 2010-11-28 11:11:51
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
按较低的那个算~~
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2楼2010-11-28 11:44:37
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yinsongna

金虫 (正式写手)
跑个梯度
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3楼2010-11-28 12:36:00
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侯云hy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-11-28 12:36:00:
跑个梯度

具体跑那个温度的梯度啊？我跑了63-53的 什么都没有 有引物二聚体，但不是很亮。
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4楼2010-11-28 12:56:31
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侯云hy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-11-28 11:44:37:
按较低的那个算~~

我跑了53度的，什么都没有。
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5楼2010-11-28 12:57:08
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fjt198719

木虫 (著名写手)

永远的菜鸟

这是我第三次回复类似问题了

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-11-28 15:26:26
本人从来不计算TM值，因为一般都是直接把目的基因全部扩增出来，设计引物都是直接手写，酶切位点当然要用软件分析下才选择的（载体上有，目的基因上无，双酶切效果好点的），扩增200-3000片段全部没得问题。SOE-PCR也没的问题，就是直接融合5个片段也没的问题，设计的中间融合引物都是50bp跟30bp的引物一起扩增，刚刚的（这里引物合成单上写的50bp的引物退火温度都是80度左右，30bp的是65左右，而我扩增的退火温度是57度，可以看出来单子上写的没用）。
本人粗略认为退火温度只与目的菌株的GC含量有关
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独YY不如众YY！！！
6楼2010-11-28 13:18:10
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):很活跃，鼓励 2010-11-28 19:26:41
引用回帖:
Originally posted by 侯云hy at 2010-11-28 12:56:31:

具体跑那个温度的梯度啊？我跑了63-53的 什么都没有 有引物二聚体，但不是很亮。

我一般都是55到70的，除非是模板有问题，通常都能P出来的
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7楼2010-11-28 19:07:16
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我们的计算方法 Tm1+Tm2/2 ---5 的值就是理论上的退火温度，但是实际上要在这个值上下浮动几度设定一个pcr温度梯度，摸一下温度，然后再大批量进行扩增！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2010-11-28 22:38:05
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侯云hy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-11-28 22:38:05:
我们的计算方法 Tm1+Tm2/2 ---5 的值就是理论上的退火温度，但是实际上要在这个值上下浮动几度设定一个pcr温度梯度，摸一下温度，然后再大批量进行扩增！

是（tm1+tm2）/2--5么？
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9楼2010-11-29 16:27:56
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