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痴书小孩

铁杆木虫 (小有名气)

[交流] 【求助】PCR退火温度及时间如何确定已有9人参与

我是新人，还不懂，是不是跟引物Tm有关，如何算呢，还有就是PCR每步的时间怎么算的，望大家指点

[ Last edited by amisking on 2010-8-25 at 20:42 ]
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1楼2010-08-25 10:49:21
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

banhf

新虫 (初入文坛)
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amisking(金币+2):good 2010-08-25 20:41:44
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
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4楼2010-08-25 14:35:21
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cbjh100

金虫 (小有名气)
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看天(金币+2):热心 公式 2010-08-26 12:32:22
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size         
公式中，Size = 引物长度。
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努力创造传奇，真诚寻找未来
9楼2010-08-26 09:56:19
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普通回帖

大飞370

铜虫 (小有名气)
★
看天(金币+1):活跃 2010-08-26 12:31:33
退火温度主要是依据GC含量，你还是多看看书吧。一半Tm值引物公司会给你。
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2楼2010-08-25 11:19:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
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看天(金币+1):鼓励 2010-08-26 12:31:45
50mM Na+的Tm值加5~10度即可作为退火温度，时间一般15s~20s足够
经典的Taq酶合成速度是1kb/min
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3楼2010-08-25 11:24:29
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张焕春

新虫 (初入文坛)
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amisking(金币+2):鼓励 2010-08-25 20:41:57
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃
或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
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5楼2010-08-25 16:00:02
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wallace974

木虫 (小有名气)
★
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退火温度要做梯度优化，时间也要做优化，前提是扩不出来的情况下，扩出来了就不必了
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万物一理，万法自然
6楼2010-08-25 16:40:15
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霍123

新虫 (初入文坛)
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amisking(金币+1):欢迎分享经验 2010-08-25 20:42:07
amisking(金币+5):新虫鼓励！ 2010-08-25 20:42:18
最好的方法就是自己设个温度梯度P一下，时间一般是30s，要是片段长的话可以适当延长，最长我试过2min，主要还是温度，时间的影响不会特别大
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7楼2010-08-25 17:53:41
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痴书小孩

铁杆木虫 (小有名气)
谢谢大家，我知道啦，但是有没有关于根据GC算温度的公式？
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8楼2010-08-26 08:42:29
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痴书小孩

铁杆木虫 (小有名气)
懂啦，谢谢
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10楼2010-08-27 08:10:47
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