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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物退火温度怎么计算？
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小虎6487

金虫 (小有名气)

[求助] PCR引物退火温度怎么计算？

最近做PCR设计了一对引物，引物序列为：
F:CGTGCCTCCTATCCACGATTCCG
R:ATTTTGCGTAATTGGGTTTGATT
  引物序列和模版完全配对的，可是实验的时候成功率很低，每次都只能扩增出来不多几个样本，引物合成报告单上正向引物的Tm值65.5度，反向引物53度，是不是因为两条引物的Tm值相差太大啊？已经尝试了好几个温度了还是扩增效率很低？
  求高手帮忙分析哪里出问题了，需要重新设计引物吗，有个同学说可以给反向引物的5'端增加几个碱基提高一下退火温度，这样做可以吗？每条引物的退火温度怎样单独计算啊？
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适者生存
1楼 2013-08-09 23:27:39
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yimingwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-08-10 14:20:13
小虎6487: 金币+5, ★有帮助 2013-08-11 09:05:23
小虎6487: 金币+10, ★有帮助 2013-08-12 18:17:21
Primer Tm Calculator在线使用。

http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/
赞一下(2人) 回复此楼
Let'sdoit.
2楼2013-08-10 00:13:26
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dearwoniu

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小虎6487: 金币+5, ★有帮助 2013-08-11 09:05:34
引物的计算方法有多种，根据其长度能够选择多种计算方法。你的引物两条引物的GC含量差异很大，必须要迁就反向引物，这样的退火温度不好设定。可以尝试给反向引物增加碱基以提高Tm值，将反向以引物的Tm提高到接近正向引物，退火温度在58-60左右再试试。
关于计算，可以借助设计惹软件。提供一文章做参考：解链温度( Tm) 不同预测方法的比较  张艳春，屈武斌，卢一鸣，周 扬，张成岗
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3楼2013-08-11 08:40:26
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amareyue

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以在两者之间设多个温度梯度自己摸索一下最适合的温度，如果有温度非特异扩增不明显，就这个温度扩增然后切胶回收自己需要的带，如果都不怎么样，非特异扩增较明显的话，就重新设计引物吧
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2013-08-11 16:30:15
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