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小虎6487

金虫 (小有名气)

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[求助] PCR引物退火温度怎么计算？

最近做PCR设计了一对引物，引物序列为：
F:CGTGCCTCCTATCCACGATTCCG
R:ATTTTGCGTAATTGGGTTTGATT
引物序列和模版完全配对的，可是实验的时候成功率很低，每次都只能扩增出来不多几个样本，引物合成报告单上正向引物的Tm值65.5度，反向引物53度，是不是因为两条引物的Tm值相差太大啊？已经尝试了好几个温度了还是扩增效率很低？
求高手帮忙分析哪里出问题了，需要重新设计引物吗，有个同学说可以给反向引物的5'端增加几个碱基提高一下退火温度，这样做可以吗？每条引物的退火温度怎样单独计算啊？

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适者生存

1楼2013-08-09 23:27:39

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dearwoniu

金虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小虎6487: 金币+5, ★有帮助 2013-08-11 09:05:34

引物的计算方法有多种，根据其长度能够选择多种计算方法。你的引物两条引物的GC含量差异很大，必须要迁就反向引物，这样的退火温度不好设定。可以尝试给反向引物增加碱基以提高Tm值，将反向以引物的Tm提高到接近正向引物，退火温度在58-60左右再试试。
关于计算，可以借助设计惹软件。提供一文章做参考：解链温度( Tm) 不同预测方法的比较张艳春，屈武斌，卢一鸣，周扬，张成岗

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3楼2013-08-11 08:40:26

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