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小虎6487

金虫 (小有名气)

[求助] PCR引物退火温度怎么计算?

最近做PCR设计了一对引物,引物序列为:
F:CGTGCCTCCTATCCACGATTCCG
R:ATTTTGCGTAATTGGGTTTGATT
  引物序列和模版完全配对的,可是实验的时候成功率很低,每次都只能扩增出来不多几个样本,引物合成报告单上正向引物的Tm值65.5度,反向引物53度,是不是因为两条引物的Tm值相差太大啊?已经尝试了好几个温度了还是扩增效率很低?
  求高手帮忙分析哪里出问题了,需要重新设计引物吗,有个同学说可以给反向引物的5'端增加几个碱基提高一下退火温度,这样做可以吗?每条引物的退火温度怎样单独计算啊?
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dearwoniu

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小虎6487: 金币+5, 有帮助 2013-08-11 09:05:34
引物的计算方法有多种,根据其长度能够选择多种计算方法。你的引物两条引物的GC含量差异很大,必须要迁就反向引物,这样的退火温度不好设定。可以尝试给反向引物增加碱基以提高Tm值,将反向以引物的Tm提高到接近正向引物,退火温度在58-60左右再试试。
关于计算,可以借助设计惹软件。提供一文章做参考:解链温度( Tm) 不同预测方法的比较  张艳春,屈武斌,卢一鸣,周 扬,张成岗
3楼2013-08-11 08:40:26
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