应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么确定变性和退火温度
61/1返回列表
查看: 3895  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

thinkerboy

铁虫 (小有名气)

[求助] 怎么确定变性和退火温度

我反转录成cDNA第一链后，以cDNA第一链为模板进行PCR反应，该怎么设置循环条件，需要94℃预变性么退火温度怎么确定，我用的是invitrogen合成的引物，它给了两个退火温度，一个是1M Na+ 的TM为66.5和67.9值，另一个是50mM Na+的TM为44.9和46.3值，这该怎么确定他的退火温度。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-1-2 at 22:54 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-01-02 22:52:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
变性温度根据酶来定
一般的酶94度95度都可以 有的比如Phusion要98度 看说明书
退火温度看引物
一般退火温度是Tm-5度 因为Tm计算方法不同有时也不必太在意 普通长度的PCR引物退火温度在55到65度之间 上手不愿意做退火温度梯度的话可以先用55度扩 有杂带的话再提高
赞一下 回复此楼
2楼2013-01-02 23:26:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
以cDNA为模板的PCR和普通用genomic DNA的PCR是差不多的，所以预变性是要做的。如果只是合成了cDNA的第一条链的话，长度不会特别长，所以模板的复杂性相对下降。至于引物的Tm，和模板的关系更不大了，是要是完全匹配的模板，只和引物的序列有关。计算引物的Tm值有多种方法，结果也稍微有些区别。引物通常是在很大一定的温度范围内都可以扩增，只是对特异性和扩增效率有些不同。最佳的退火温度需要自己实验摸索。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2013-01-03 06:54:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
thinkerboy: 金币+1 2013-01-07 23:34:33
普通PCR的Na+浓度一般是50 mM，参考后者
真实退火温度不止与Na+浓度有关，还和Mg2+浓度、dNTP浓度有关
这个也就是个参考
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2013-01-04 18:19:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hdzhonghai

铁虫 (初入文坛)
刚开始做PCR，才学着看资料。

想问一下qPCR的反应温度是参考别人的反应条件还是参考试剂的说明，用的是ABI的SYBR。谢谢！
赞一下 回复此楼
5楼2016-06-09 20:59:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yaohuaibing

铁杆木虫 (著名写手)
pcr条件根据你用的酶，taq酶94或95  star96 ，一般30循环。退火文都一般不考虑引物的文都 56-58都可以试试，如果有杂带，建议提高退火温度即可
赞一下 回复此楼
每天都在读书和读人。书易懂，人难解。
6楼2016-06-09 23:08:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 thinkerboy 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭