24小时热门版块排行榜

返回列表

thinkerboy

铁虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 3.6
散金: 1
帖子: 69
在线: 44.8小时
虫号: 2099002
注册: 2012-10-31
性别: GG
专业: 细胞衰老

[求助] 怎么确定变性和退火温度

我反转录成cDNA第一链后，以cDNA第一链为模板进行PCR反应，该怎么设置循环条件，需要94℃预变性么退火温度怎么确定，我用的是invitrogen合成的引物，它给了两个退火温度，一个是1M Na+ 的TM为66.5和67.9值，另一个是50mM Na+的TM为44.9和46.3值，这该怎么确定他的退火温度。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-1-2 at 22:54 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

为呼吸打开通道：依伐卡托的科学之旅已经有1人回复
Dordaviprone（ONC201）：小分子药物在中线胶质瘤中的应用已经有0人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有121人回复
依喜替康：新型喜树碱衍生物的研究进展已经有1人回复
膀胱癌靶向治疗新选择：厄达替尼作用机制与耐药研究进展已经有0人回复
从水母到实验室：腔肠素的发现历程与生物发光奥秘已经有1人回复
线粒体氧化磷酸化的新靶点：S-Gboxin的发现与研究进展已经有0人回复
PROTAC药物开发选择VHL配体：MDK-7526以87%出口向量占有率成首选已经有0人回复
MCC950：NLRP3炎症小体特异性抑制剂的科研应用与前景已经有0人回复
康替唑胺研发17年：如何解决多重耐药菌感染难题已经有0人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

pcr的温度及时间的选择已经有8人回复
求解PCR问题《忘记加水的前后》已经有13人回复
SSR引物退火温度如何确定，求助！已经有9人回复
rt-pcr图，请大神们帮助分析一下，急。。。谢谢。。。已经有20人回复
基因工程课程小结已经有20人回复
求助PCR反应参数设置已经有9人回复
玉米转基因植株的检测中遇到的问题已经有10人回复
【求助】高碳钢高温退火的温度怎么设定？已经有13人回复
【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？已经有20人回复
【求助/交流】还是pcr问题已经有10人回复
【求助/交流】pcr求解已经有11人回复
半定量PCR的详细步骤已经有7人回复
【求助】PCR退火温度及时间如何确定已经有10人回复
【求助】合金的均匀化退火温度如何选取？已经有11人回复
【求助/交流】PCR 总是没P出来已经有21人回复
【求助/交流】（5.20更新）PCR产物电泳没有条带，why? 已经有20人回复

1楼 2013-01-02 22:52:15

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

ccharlien

木虫 (正式写手)

MolEPI: 1
应助: 82 (初中生)
金币: 2630.1
红花: 3
帖子: 334
在线: 180.3小时
虫号: 1168776
注册: 2010-12-13
性别: GG

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

变性温度根据酶来定
一般的酶94度95度都可以有的比如Phusion要98度看说明书
退火温度看引物
一般退火温度是Tm-5度因为Tm计算方法不同有时也不必太在意普通长度的PCR引物退火温度在55到65度之间上手不愿意做退火温度梯度的话可以先用55度扩有杂带的话再提高

赞一下

回复此楼

2楼2013-01-02 23:26:23

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

MolEPI: 10
应助: 1662 (讲师)
金币: 8693.8
红花: 72
帖子: 3516
在线: 456小时
虫号: 1614001
注册: 2012-02-13
专业: 生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

以cDNA为模板的PCR和普通用genomic DNA的PCR是差不多的，所以预变性是要做的。如果只是合成了cDNA的第一条链的话，长度不会特别长，所以模板的复杂性相对下降。至于引物的Tm，和模板的关系更不大了，是要是完全匹配的模板，只和引物的序列有关。计算引物的Tm值有多种方法，结果也稍微有些区别。引物通常是在很大一定的温度范围内都可以扩增，只是对特异性和扩增效率有些不同。最佳的退火温度需要自己实验摸索。

赞一下(1人)

回复此楼

3楼2013-01-03 06:54:01

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖