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thinkerboy

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[求助] 怎么确定变性和退火温度

我反转录成cDNA第一链后，以cDNA第一链为模板进行PCR反应，该怎么设置循环条件，需要94℃预变性么退火温度怎么确定，我用的是invitrogen合成的引物，它给了两个退火温度，一个是1M Na+ 的TM为66.5和67.9值，另一个是50mM Na+的TM为44.9和46.3值，这该怎么确定他的退火温度。

[ Last edited by thinkerboy on 2013-1-2 at 22:54 ]

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1楼 2013-01-02 22:52:15

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ccharlien

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【答案】应助回帖

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变性温度根据酶来定
一般的酶94度95度都可以有的比如Phusion要98度看说明书
退火温度看引物
一般退火温度是Tm-5度因为Tm计算方法不同有时也不必太在意普通长度的PCR引物退火温度在55到65度之间上手不愿意做退火温度梯度的话可以先用55度扩有杂带的话再提高

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2楼2013-01-02 23:26:23

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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以cDNA为模板的PCR和普通用genomic DNA的PCR是差不多的，所以预变性是要做的。如果只是合成了cDNA的第一条链的话，长度不会特别长，所以模板的复杂性相对下降。至于引物的Tm，和模板的关系更不大了，是要是完全匹配的模板，只和引物的序列有关。计算引物的Tm值有多种方法，结果也稍微有些区别。引物通常是在很大一定的温度范围内都可以扩增，只是对特异性和扩增效率有些不同。最佳的退火温度需要自己实验摸索。

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3楼2013-01-03 06:54:01

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