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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】还是pcr问题
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鹏飞九万里

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】还是pcr问题已有10人参与

我的目的基因片段约5kb，用的takara的long taq 酶，引物tm值为62度，按照买来的takara上的说明书加的量，pcr程序为
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58    30s
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电泳后只有引物二聚体，请教各位大侠，帮忙分析下原因，谢谢啊。。。
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1楼2011-02-22 15:27:06
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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Tm不是62吗？怎么变成58了，循环数呢？
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-02-22 16:09:37
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 鼓励 2011-02-22 18:44:48
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-02-22 18:45:28

确定引物没问题。确定体系没问题   单pcr条件不足说明什么。

   ps  最后延伸时间太短 是可以确定的。   预变性一般30s
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3楼2011-02-22 16:57:22
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 是的 有点长 2011-02-22 18:45:05
1949stone(金币+2): 是的 有点长 2011-02-22 18:45:24

因为片段有些长，延伸时间可以长一些，循环数多一些，还有退火温度怎么感觉不对啊~
最好先设个温度梯度试试！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-02-22 17:08:54
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冬虫夏草1

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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1949stone(金币+2): 是的 2011-02-22 18:45:22

引物二聚体多为体系浓度失调引起的，再优化一下PCR体系吧。退火温度应该没问题，一般为Tm—5.
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倚楼听风雨，淡看江湖路！
5楼2011-02-22 18:43:21
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513279618

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

应该是退火温度不对，优化一下条件，如果还是连弥散带都不出的话，可能你模板有问题
。
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6楼2011-02-22 19:16:51
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jerry110

新虫 (小有名气)
★
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调节退火温度，优化体系，没有一下就成功的
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7楼2011-02-22 19:47:52
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phoenix211

金虫 (小有名气)
★
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做个温度梯度。
然后延伸时间再稍微多一点点。
这个原因很多，只能一个一个地试。
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8楼2011-02-22 19:48:34
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raul146

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
内容已删除
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9楼2011-02-22 19:57:17
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cyz20050505

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 鹏飞九万里 at 2011-02-22 15:27:06:
我的目的基因片段约5kb，用的takara的long taq 酶，引物tm值为62度，按照买来的takara上的说明书加的量，pcr程序为
94    6min
94   1min
58    30s
72    5min
72    10min
电泳后只有引物二聚体，请教各位 ...

LA-PCR对模板质量和引物结构要求比较严格，尽量用试剂盒提取DNA，主要怀疑是引物结构，不要去迷信primer或者oligo这些软件给出的引物评分，多设计几条，试试
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10楼2011-02-24 19:47:21
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