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鹏飞九万里

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】还是pcr问题 已有10人参与

我的目的基因片段约5kb,用的takara的long taq 酶,引物tm值为62度,按照买来的takara上的说明书加的量,pcr程序为
94    6min
94   1min
58    30s
72    5min
72    10min
电泳后只有引物二聚体,请教各位大侠,帮忙分析下原因,谢谢啊。。。
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cyz20050505

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 鹏飞九万里 at 2011-02-22 15:27:06:
我的目的基因片段约5kb,用的takara的long taq 酶,引物tm值为62度,按照买来的takara上的说明书加的量,pcr程序为
94    6min
94   1min
58    30s
72    5min
72    10min
电泳后只有引物二聚体,请教各位 ...

LA-PCR对模板质量和引物结构要求比较严格,尽量用试剂盒提取DNA,主要怀疑是引物结构,不要去迷信primer或者oligo这些软件给出的引物评分,多设计几条,试试
10楼2011-02-24 19:47:21
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流

Tm不是62吗?怎么变成58了,循环数呢?
Thank-you,so-blue.
2楼2011-02-22 16:09:37
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-02-22 18:44:48
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-02-22 18:45:28

确定引物没问题。确定体系没问题   单pcr条件不足说明什么。

   ps  最后延伸时间太短 是可以确定的。   预变性一般30s
3楼2011-02-22 16:57:22
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 是的 有点长 2011-02-22 18:45:05
1949stone(金币+2): 是的 有点长 2011-02-22 18:45:24

因为片段有些长,延伸时间可以长一些,循环数多一些,还有退火温度怎么感觉不对啊~
最好先设个温度梯度试试!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-02-22 17:08:54
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