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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

[求助] 玉米转基因植株的检测中遇到的问题

最近一直在做玉米转基因植株的检测,但是总也没有目的带。想知道是怎么做的,基因组有什么要求OD260: OD280为多少,多少纳克。具体的体系等等,我的引物最适合退火为53度。目的基因1400bp.
麻烦大家帮一下忙啊,急着要毕业,要是出不来结果会被延期啊~~·
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

wzhgaochuan(金币+2): 谢谢您的回答啦,受益匪浅,希望试验能出来。 2011-08-12 15:49:36
写的太不详细了。是自己做的转基因植株的验证,还是市面上买来的玉米面的转基因检测?不管哪种,都不该用1.4k的检测pcr,太长了,300-500还差不多。直接从叶片提基因组比较简单,用于做pcr模板的话,质量要求不是那么高。建议多了解一下转基因的插入序列,只选目的基因的一段用来做pcr,只要这一段是野生型玉米里面没有的就行。
How about the future?
2楼2011-08-12 09:31:02
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

我的是自己的转基因材料检测,就是从叶片中提取的基因组,不过浓度不高30ng/ul。插入的目的基因全长2.4K。那应该怎么设计体系呢?还有退火温度。按照PP5中的Ta Opt值吗?谢谢了
3楼2011-08-12 10:49:26
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

选插入序列的一段用来作为靶片段,这个片段一般是玉米基因组中本身没有的。例如如果使用玉米的ubi启动子,就不能针对ubi启动子设计引物,而要根据ubi启动的后半段序列加上插入编码区(或RNAi茎环的茎区)前半段,约在400-600bp的靶片段设计引物。产物要避开诸如RNAi的茎环结构区。退火温度可以通过实验确定。
How about the future?
4楼2011-08-12 11:44:49
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

DNA的OD260:OD280在1.6到1.8之间为正常,高于这个值说明有RNA污染,低于这个值说明有蛋白质,酚类的污染。转基因的验证一般可以通过目的基因的PCR检测、southern杂交等进行检测。一般一个OD260相当于0.5微克每微升DNA。
5楼2011-08-12 15:05:47
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

我的反应体系:即在25μL体系中,模板DNA50-160ng(3-8ul),1×PCR buffer,dNTPs62.5pmol/μL,Primers0.25pmol/μL,Taq DNA polymerase1.25U。反应程序为:94℃预变性10min;94℃变性50S,54℃退火40S,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min,4℃保存。也试过降落PCR.61-51℃各一个循环,最后在55℃变性24个循环。最后也是没有目的条带。PP5上引物退火温度为Tm [°C]  57.8  和58.7,产物的 Ta Opt [°C] 为 54.3。目的带为893bp
6楼2011-08-12 17:31:49
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zltj2008

铜虫 (小有名气)

恩 模板浓度我觉得可以不用加这么多  20ng左右 如果有的话,应该足可以扩的出来,多的话,效果反而不好。而且玉米基因组本身的GC含量就挺高的 挺不好鉴定的  多试几对引物看看
7楼2011-08-13 15:03:47
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

正在设计引物,目的片段400-600希望能扩出来吧。各路大神保佑
8楼2011-08-13 17:15:10
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w2boluo

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wzhgaochuan at 2011-08-12 17:31:49:
我的反应体系:即在25μL体系中,模板DNA50-160ng(3-8ul),1×PCR buffer,dNTPs62.5pmol/μL,Primers0.25pmol/μL,Taq DNA polymerase1.25U。反应程序为:94℃预变性10min;94℃变性50S,54℃退火40S,7 ...

模板是试剂盒提的还是ctab法提的?如果是后者,杂质含量一般不低,25ul体系里加这么多实在是多了。模板减少点试试,像这种浓度的,几个ng的模板已经足够了,个人倾向于使用0.5-1ul模板。pp5的计算值一般偏高,引物在20个碱基左右可以直接用2XAT个数+4XGC个数的经验公式估算,我一般是直接先用50度或者48度试试。酶体系也很关键,893bp用takara的extaq和rtaq扩增一般很不给力,我会直接用LA,楼上很多人说玉米基因组含量比较高,那变性温度我会用95度,然后扩不出来就用LA taq酶所附带的GC buffer,酱紫。
How about the future?
9楼2011-08-13 21:35:09
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jianghy69

铜虫 (正式写手)

转基因的检测方法:southern、northern、RT PCR。
10楼2012-04-25 11:04:44
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